芽胞桿菌浸種對水稻內生細菌群落結構的影響

沙月霞,沈瑞清

寧夏農林科學院植物保護研究所,銀川 750011

芽胞桿菌屬(Bacillus)屬于細菌界的厚壁菌門(Firmicutes)。稻瘟病是水稻生產中危害最嚴重的病害,由子囊菌Magnaportheoryzae(T.T.Hebert)Yaegashi &Udagawa(無性態：Pyriculariaoryzae)引起[1],一般情況下每年造成20%—30%的產量損失,嚴重的田塊顆粒無收[2]?；瘜W農藥是防治稻瘟病最常用的藥劑,但是大量重復使用容易污染生態環境,對人類健康也帶來極大的威脅。因此,選用對生態環境無污染、殺菌效果明顯的生防菌劑防治稻瘟病越來越受到關注。多項研究表明,芽胞桿菌產生抗逆性極強的芽胞,防病促生效果顯著,對人畜無害,不易使病原菌產生抗藥性,對生態環境安全,是防治稻瘟病的重要生防種質資源。已有研究表明貝萊斯芽胞桿菌(B.velezensis)E69、解淀粉芽胞桿菌(B.amyloliquefaciens)S170和短小芽胞桿菌(B.pumilus)S9對稻瘟病的防效明顯[3],可以用于水稻可持續發展中稻瘟病的生物防治。

植物內生菌具有重要的生態功能,是植物微生態系統的重要組成部分[4-5],植物內生菌群落結構受地理環境[6-7]、栽培條件、品種基因型[8-9]、組織部位[10]、噴施藥劑的影響。植物內生菌的群落結構與植物品種抗性密切相關[11-12],植物內生細菌是非常重要的內生菌資源,內生細菌的群落結構是否穩定也會影響植物品種的抗性。馮杭等[13]研究證實了番茄抗病品種的內生細菌總數量顯著高于感病品種。West等[14]研究表明葡萄抗病品種的內生細菌的菌群結構和多樣性與感病品種差異顯著。

水稻內生細菌的群落多樣性是衡量水稻植株是否健康的指標之一。已有的研究證實水稻內生細菌的生態功能包括增強水稻抗病蟲害的能力[15]、促進植株生長或者增加產量[16-17]、提高抗逆境的能力[18]、加強寄主對氮等營養物質的吸收與代謝[19-20]、降解重金屬污染和農藥殘留、與寄主互作等[21]。農藥的施用對水稻內生細菌的群落多樣性的影響較明顯。崔凱等[22]發現吡蟲啉、噻蟲嗪和苯醚甲環唑噴施后顯著降低水稻根系內生細菌群落豐富度。運用生物農藥防治水稻病害已成為研究熱點,但是對水稻內生細菌群落多樣性的影響研究報道較少。

因此,本研究利用Illumina MiSeq測序技術研究芽胞桿菌浸種處理對水稻組織內生細菌群落多樣性的影響。一方面明確芽胞桿菌浸種處理對水稻根部、莖部和葉部內生細菌的菌群組成、群落結構以及多樣性的影響；另一方面剖析水稻組織內生細菌群落與水稻品種抗性之間的關系,從而揭示芽胞桿菌浸種處理對水稻品種抗性的影響。本文旨在為芽胞桿菌殺菌劑在水稻產業可持續發展中的應用提供科學依據。

1 研究材料和方法

1.1 試驗地概況

試驗于2018年8月—9月在寧夏農林科學院植物保護研究所日光溫室進行(38°47′N,106°27′E,海拔高度1080 m)。種植土壤為營養土,有機質含量≥12.0%,腐殖植酸含量≥28%,水分≤20.0%,pH值4.0—8.0。

1.2 試驗設計

試驗設置12組樣本處理,每組樣本3個重復,分別是葉部樣本L(Leaf)：無菌水對照(CKL)、短小芽胞桿菌S9(S9L)、解淀粉芽胞桿菌S170(S170L)和貝萊斯芽胞桿菌E69(E69L)；莖部樣本S(Stem)：無菌水對照(CKS)、短小芽胞桿菌S9(S9S)、解淀粉芽胞桿菌S170(S170S)和貝萊斯芽胞桿菌E69(E69S)；根部樣本R(Root)：無菌水對照(CKR)、短小芽胞桿菌S9(S9R)、解淀粉芽胞桿菌S170(S170R)和貝萊斯芽胞桿菌E69(E69R)。

1.3 水稻種植與樣本采集

試驗水稻品種為G19號,健康種子在70%酒精中浸泡20 min,采用無菌水重復沖洗,沖洗后的種子分別在100 mL不同芽胞桿菌發酵液(1×108CFU/mL)中浸泡30 min,對照在無菌水中浸泡30 min,所有浸種后的水稻種子放置在28 ℃人工氣候箱中,2 d后播種于塑料杯中(底部直徑5.3 cm×上部直徑9.5 cm×高11.5 cm)。每個塑料杯里播種5粒種子,每個塑料托盤里放6個塑料杯,每個處理種植24個塑料杯。

水稻種植20 d后采集樣本,分別采集完整根系、莖基部2 cm的莖部組織和葉片中部大約10 cm的葉段。

1.4 抽提水稻內生細菌的基因組DNA

先用蒸餾水沖洗根系表面,直至肉眼所見異物完全洗掉。所有樣本在1%次氯酸鈉溶液中浸泡10 min,然后在70%酒精中浸泡1 min,最后用無菌水反復清洗,最后一次沖洗液在NA固體培養基上涂平板,30 ℃培養48 h后,NA平板上未長出菌落視為樣本表面無菌。提取所有表面無菌樣本的基因組總DNA,進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 16S rDNA測序

對水稻內生細菌的16S rRNA基因V5-V7高變區進行PCR擴增,擴增引物是799F：5′-barcode-AACMGGATTAGTAGATACCCKG-3′,1193R：5′-ACGTCATCCCCACCTTCC-3′[22],特異性引物需要包含barcode,由上海美吉生物醫藥科技有限公司合成。PCR反應體系(20 μL)包括2 μL的10×PCR Buffer,2 μL的2.5 mmol/L dNTPs,0.8 μL的5 μmol/L正向引物,0.8 μL的5 μmol/L反向引物,0.2 μL的rTaq Polymerase,0.2 μL的BSA,10 ng的Template DNA,補ddH2O至20 μL。反應條件包括95 ℃ 3 min；循環數×(95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s)；72 ℃ 10 min,10 ℃直到反應結束。第二輪PCR擴增產物采用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統(Promega公司)對PCR產物進行檢測定量、按照一定比例混合,最后利用Illumina公司的Miseq 2×300平臺測序。

1.6 數據處理與分析

選用Chao作為評價群落豐富度的指標、Shannoneven作為評估群落均勻度的指標、Shannon作為衡量群落多樣性的指標、Coverage作為反映覆蓋度的指標。Shannon的數值越高,表明微生物的群落多樣性越高；Shannoneven數值越高,表明微生物的群落均勻度越高；Coverage的數值越高,表明樣本序列檢測出的概率越高,能夠真實反映樣本序列的檢出情況。微生物群落Alpha多樣性數據采用mothur (version v.1.30.1 http://www.mothur.org/wiki/Schloss_SOP#Alpha_diversity)進行統計分析。

使用DPS15.0軟件完成統計分析,顯著性分析采用單因素方差分析中的最小極差法(Least significant ranges,LSD)(P<0.05),數據為平均值±標準誤。

2 結果分析

2.1 芽胞桿菌浸種后水稻樣本內生細菌序列統計和多樣性

采用Flash軟件,原始序列數據通過拼接、質控過濾和聚類分析去除嵌合體,從而獲得優化序列用于進一步分析。12組處理36個樣本共獲得786298個有效序列,每個樣本平均21842個序列。所有樣本的序列通過聚類分析,序列相似的劃分為一個小組,稱之為分類單元(Operational Taxonomic Units,OTU)。一般情況下,對相似水平在97%的OTU數量和多樣性指數進行生物信息學統計分析,36個樣本共獲得1576個OTU。根部組織的OTU范圍是64—123,莖部組織的OTU范圍是67—93,葉部組織的OTU范圍是8—12。芽胞桿菌浸種后對水稻根部和莖部內生細菌的OTU影響顯著(P<0.05),對葉部內生細菌的OTU沒有顯著影響(P>0.05)。

Alpha多樣性可以評估微生物群落的物種豐富度、多樣性、均勻度和覆蓋度等指標。本研究通過Alpha多樣性數據剖析芽胞桿菌浸種處理對水稻不同組織內生細菌群落多樣性、豐富度、均勻度的影響,結果見表1。水稻根系、莖部和葉片內生細菌群落的豐富度指數Chao指數呈現一致的變化趨勢：R>S>L,其中S9R>E69R>S170R>CKR,S9S>S170S>CKS>E69S,E69L>S9L>S170L>CKL,芽胞桿菌浸種處理增加了水稻根系和莖部組織內生細菌群落的豐富度(P<0.05),對葉部組織內生細菌群落的豐富度沒有顯著影響(P>0.05)。水稻組織內生細菌的多樣性指標(Shannon)變化特征差異較小：R≌S>L,芽胞桿菌浸種對水稻根部、莖部和葉部組織內生細菌群落的多樣性有顯著影響(P<0.05)。均勻度指標(Shannoneven)：S>R>L,芽胞桿菌浸種可以增加水稻根部和莖部組織內生細菌群落的均勻度(P<0.05),降低葉部內生細菌群落的均勻度(P<0.05)。

表1 芽胞桿菌浸種對水稻組織內生細菌群落多樣性的影響Table 1 Impact of seed soaked by Bacillus on endophytic bacterial community diversity of rice

CKL：無菌水對照處理組的葉部樣本；S9L：短小芽胞桿菌S9處理組的葉部樣本；S170L：解淀粉芽胞桿菌S170處理組的葉部樣本；E69L：貝萊斯芽胞桿菌E69處理組的葉部樣本；CKS：無菌水對照處理組的莖部樣本；S9S：短小芽胞桿菌S9處理組的莖部樣本；S170S：解淀粉芽胞桿菌S170處理組的莖部樣本；E69S：貝萊斯芽胞桿菌E69處理組的莖部樣本；CKR：無菌水對照處理組的根部樣本；S9R：短小芽胞桿菌S9處理組的根部樣本；S170R：解淀粉芽胞桿菌S170處理組的根部樣本；E69R：貝萊斯芽胞桿菌E69處理組的根部樣本；不同字母代表顯著性分析(最小極差法LSD,P≤0.05)

圖1 芽胞桿菌浸種后水稻組織內生細菌群落的主坐標分析(OTU水平)Fig.1 Principal co-ordinates analysis (PCoA)of seed soaked by Bacillus on endophytic bacterial community of rice tissue (OTU level)表頭“PCoA on OTU level”：在OTU水平上的主坐標分析；PC1代表第一主成分；PC2代表第二主成分；CKL：無菌水對照處理組的葉部樣本；S9L：短小芽胞桿菌S9處理組的葉部樣本；S170L：解淀粉芽胞桿菌S170處理組的葉部樣本；E69L：貝萊斯芽胞桿菌E69處理組的葉部樣本；CKS：無菌水對照處理組的莖部樣本；S9S：短小芽胞桿菌S9處理組的莖部樣本；S170S：解淀粉芽胞桿菌S170處理組的莖部樣本；E69S：貝萊斯芽胞桿菌E69處理組的莖部樣本；CKR：無菌水對照處理組的根部樣本；S9R：短小芽胞桿菌S9處理組的根部樣本；S170R：解淀粉芽胞桿菌S170處理組的根部樣本；E69R代表貝萊斯芽胞桿菌E69處理組的根部樣本。不同字母代表顯著性分析(最小極差法LSD,P≤0.05±標準誤)

Beta多樣性主要用于比較微生物群落間的差異,主坐標分析(Principal Co-ordinates Analysis,PCoA分析)是最常見的評估方法。通過PCoA分析,發現不同處理之間多樣性差異較明顯(圖1)。PCoA的前2個主成分軸解釋了67.79%的群落差異,其中軸Ⅰ和軸Ⅱ分別是56.89%和10.90%,貝萊斯芽胞桿菌E69、解淀粉芽胞桿菌S170和短小芽胞桿菌S9浸種處理后葉部的細菌群落非常相似。CK、S170和S9處理的根部內生細菌群落聚合在一個象限內,其他處理內生細菌群落明顯分開。Beta分析結果說明芽胞桿菌浸種處理對水稻根內生細菌群落影響較大,對水稻莖部內生細菌群落影響較小,對葉部內生細菌的影響不明顯。

2.2 芽胞桿菌浸種對水稻組織內生細菌群落結構的影響

2.2.1芽胞桿菌浸種對內生細菌OTU的影響

芽胞桿菌浸種處理對水稻G19根部組織內生細菌群落的影響趨勢一致,顯著增加了OTU(序列數≥5)的數量(P<0.05),S9R(92±0.33)>E69R(80±1.53)>S170R(67±3.84>CKR(56±8.45)。根部內生細菌群落至少屬于5個門,9—11個綱,13—18個目,22—34個科,36—57個屬,65—123個OTU。芽胞桿菌浸種處理對水稻G19莖部組織內生細菌群落的影響趨勢一致,顯著降低了OTU(序列數≥5)的數量(P<0.05),S9S(69±4.81)>S170S(63±1.15)>E69S(55±0.67)>CKS(54±1.86)；增加了細菌目和科的數量。莖部內生細菌群落至少屬于4—5個門,9—11個綱,15—18個目,25—28個科,36—49個屬,67—93個OTU。芽胞桿菌浸種處理對水稻G19葉部組織內生細菌群落的影響趨勢不一致,對OTU(序列數≥5)的數量沒有顯著影響(P>0.05)：S9L(7±1.21)>S9L(6±0.33)>S170L(5±0.58)=E69L(5±1.21)；S170浸種處理降低了葉部內生細菌門、綱、屬的數量；E69浸種處理增加門、目、科和屬的數量；S9浸種處理降低了綱、目和科的數量,增加了細菌屬的數量。水稻品種G19葉部組織的內生細菌群落隸屬于2—4個門,4—6個綱,6—8個目,6—9個科,8—11個屬,8—12個OTU。

2.2.2芽胞桿菌浸種對水稻內生細菌門水平豐度的影響

根部內生細菌中相對豐度≥1%的門有3個,主要包括變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes),其余2個門所占比例均低于1%(圖2)。芽胞桿菌浸種處理對水稻根部內生細菌的變形菌門豐度影響不顯著(P>0.05),E69R(75.13%±3.31%)>CKR(71.65%±9.23%)>S9R(69.65%±1.26%)>S170R(64.21%±3.20%)；增加擬桿菌門的豐度,S170R(27.19%±0.52%)>S9R(24.82%±3.77%)>E69R(18.08%±3.32%)>CKR(11.91%±9.68%)；降低厚壁菌門的豐度,CKR(16.16%±9.34%)>S170R(8.05%±3.01%)>E69R(6.46%±0.71%)>S9R(5.25%±2.57%)。

莖部的優勢內生細菌菌群主要是變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門,芽胞桿菌浸種處理對細菌門豐度影響顯著(P<0.05),擬桿菌門的豐度增加,厚壁菌門的豐度下降(圖2)。變形菌門的豐度變化趨勢是：E69S(85%±3.69%)>S9S(76.32%±0.48%)>CKS(75.51%±4.32%)>S170S(69.45%±6.31%)；厚壁菌門的豐度變化趨勢是：CKS(20.34%±3.66%)>S9S(7.22%±4.55%)>S170S(7.64%±1.07%)>E69S(6.84%±5.11%)；擬桿菌門的豐度趨勢是：S170S(22.43%±1.29%)>S9S(16.13%±1.56%)>E69S(7.86%±1.96%)>CKS(1.8%±0.69%)。

圖2顯示芽胞桿菌浸種后顯著影響了葉部內生細菌群落的優勢菌群(P<0.05)：增加了厚壁菌門的相對豐度,E69L(99.97%±0.01%)>S170L(99.96%±0.01%)>S9L(99.61%±0.11%)>CKL(74.20%±0.58%)；降低了變形菌門的豐度,CKL變形菌門(25.79%±0.17%),芽胞桿菌浸種處理后變形菌門的相對豐度范圍是0.02%—0.39%。

圖2 芽胞桿菌浸種對水稻組織內生細菌菌群組成的影響(門水平)Fig.2 Impact of seed soaked by Bacillus on endophytic bacterial community structure of rice tissue (phylum level)

2.2.3芽胞桿菌浸種對水稻內生細菌綱水平豐度的影響

芽胞桿菌浸種處理后水稻組織內生細菌隸屬于11個綱(圖3),有6個綱的相對豐度≥1%。芽胞桿菌浸種處理對水稻根部組織內生細菌綱的影響趨勢一致,增加了根部組織中γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、黃桿菌綱(Flavobacteriia)、梭菌綱(Clostridia)和α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)的相對豐度,E69R>S170R>S9R>CKR；降低了β-變形菌綱(Betaproteobacteria)和芽胞桿菌綱(Bacilli)的相對豐度,CKR>S170R>E69R>S9R。其中γ-變形菌綱(39.31%—69.17%)、α-變形菌綱(0.62%—6.29%)和β-變形菌綱(3.42%—31.69%)隸屬于變形菌門,芽胞桿菌綱(2.21%—15.91%)和梭菌綱(0.25%—3.43%)屬于厚壁菌門,黃桿菌綱(11.63%—24.50%)屬于擬桿菌門。

芽胞桿菌浸種處理對水稻莖部組織內生細菌綱的影響趨勢不一致,增加了黃桿菌綱、β-變形菌綱、α-變形菌綱的相對豐度,S170和S9增加了γ-變形菌綱和芽胞桿菌的相對豐度,E69降低了γ-變形菌綱和芽胞桿菌的相對豐度；3株芽胞桿菌浸種處理降低了水稻莖部梭菌綱的相對豐度。

水稻葉部內生細菌綱主要包括γ-變形菌綱和芽胞桿菌綱,芽胞桿菌浸種處理對細菌綱的影響趨勢一致,降低了γ-變形菌綱的相對豐度,增加了芽胞桿菌綱的相對豐度。清水對照CK葉部的γ-變形菌綱和芽胞桿菌綱豐度分別是25.78%±0.83%和74.21%±0.58%,芽胞桿菌浸種后葉部的芽胞桿菌綱豐度達到99.64%以上,S170和E69處理組分別達到99.97%±0.05%和99.93%±0.01%。

圖3 芽胞桿菌浸種對水稻組織內生細菌菌群組成的影響(綱水平)Fig.3 Impact of seed soaked by Bacillus on endophytic bacterial community structure of rice tissue (Class level)

2.2.4芽胞桿菌浸種對水稻內生細菌屬水平豐度的影響

相對豐度≥5%為水稻組織的優勢菌屬,芽胞桿菌浸種處理對水稻組織優勢菌屬影響趨勢一致(圖4)。清水對照根部內生細菌優勢菌屬是腸桿菌屬(Enterobacter)、單胞菌屬(Stenotrophomonas)、成團泛菌屬(Pantoea)、馬賽菌屬(Massilia)、伯克霍爾德菌(Burkholderia-Paraburkholderia)、黃桿菌屬(Flavobacterium)和魯梅爾芽胞桿菌屬(Rummeliibacillus)；芽胞桿菌浸種處理組的優勢菌屬是檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、金黃桿菌屬(Chryseobacterium)、腸桿菌屬、單胞菌屬和克雷伯菌屬(Klebsiella)。成團泛菌屬(10.93%±5.51%)、馬賽菌屬(23.05%±7.54%)、伯克霍爾德菌(8.21%±5.34%)、黃桿菌屬(7.07%±6.41%)和魯梅爾芽胞桿菌屬(8.79%±6.49%)是清水對照獨有的優勢菌屬,檸檬酸桿菌屬(2.05%—31.44%)、金黃桿菌屬(17.25%—26.18%)和克雷伯菌屬(5.66%—21.06%)是芽胞桿菌處理組獨有的優勢菌屬。試驗結果表明芽胞桿菌浸種處理顯著增加檸檬酸桿菌屬、金黃桿菌屬、克雷伯菌屬的豐度,顯著降低腸桿菌屬、成團泛菌屬、馬賽菌屬、伯克霍爾德菌、黃桿菌屬、魯梅爾芽胞桿菌屬的相對豐度。

清水對照莖部內生細菌優勢菌屬是假單胞菌屬(Pseudomonas)、檸檬酸桿菌屬、腸桿菌屬、克雷伯菌屬、毛螺菌屬(Lachnospiraceae)。芽胞桿菌浸種處理優勢菌屬是假單胞菌屬、金黃桿菌屬、腸桿菌屬、單胞菌屬和叢毛單胞菌屬(Comamonas)。其中檸檬酸桿菌屬(23.91%±2.84%)、克雷伯菌屬(7.82%±0.83%)和毛螺菌屬(18.44%±3.79%)是清水對照莖部獨有的優勢菌屬,金黃桿菌屬(6.26%—15.42%)、單胞菌屬(5.49%—9.10%)和叢毛單胞菌屬(3.30%—8.31%)是芽胞桿菌浸種處理組獨有的優勢菌屬。試驗結果證實芽胞桿菌浸種處理增加了金黃桿菌屬、單胞菌屬、叢毛單胞菌屬的相對豐度,顯著降低叢毛單胞菌屬、克雷伯菌屬、成團泛菌屬、毛螺菌屬的相對豐度。

芽胞桿菌浸種后對水稻葉部內生細菌的優勢菌屬影響顯著(P<0.05),顯著增加內生芽胞桿菌屬的相對豐度,S170L(99.96%±0.01%)>E69L(99.93%±0.04%)>S9L(99.64%±0.24%)>CKL(74.21%±1.17%)；降低成團泛菌屬的相對豐度,CKL的豐度是 23.58%±9.84%,芽胞桿菌浸種后葉片內部未檢測出成團泛菌屬。芽胞桿菌浸種處理后葉部組織的內生芽胞桿菌屬與接種芽胞桿菌的16S序列的相似性需要通過傳統培養法進一步驗證。

圖4 芽胞桿菌浸種對水稻組織內生細菌菌群組成的影響(屬水平)Fig.4 Impact of seed soaked by Bacillus on endophytic bacterial community structure of rice tissue (Genus level)

2.3 芽胞桿菌浸種后水稻組織內生細菌的共有和獨有物種

Venn圖可以用于比較樣本中共有和獨有的OTU數量情況。芽胞桿菌浸種處理后顯著影響水稻根部、莖部和葉部內生細菌群落中的OTU數量(P<0.05),芽胞桿菌種類不同,對內生細菌OTU影響也不相同,幾個處理之間既有共有OTU,又有獨有OTU。

圖5顯示4個處理根部內生細菌的共有OTU物種是64個,不同處理之間也具有相同的OTU物種。CK的獨有OTU數量是6個,S170、E69和S9獨有的OTU數量分別是1個、11個和13個。

圖6顯示4個處理莖部內生細菌的共有OTU物種是55個,CK獨有OTU數量是3個,S170、E69和S9獨有的OTU數量分別是4個、2個和9個。

圖7顯示4個處理葉部內生細菌共有的OTU只有4個,CK獨有OTU數量是4個,S170、S9和E69浸種后葉部獨有的OTU數量分別是2個、4個和5個。

圖5 芽胞桿菌浸種對水稻根部組織內生細菌OTU的影響(Venn分析)Fig.5 Impact of seed soaked by Bacillus on endophytic bacterial community OTU of rice root (Class level)(Venn analysis)

圖6 芽胞桿菌浸種對水稻莖部組織內生細菌OTU的影響(Venn分析)Fig.6 Impact of seed soaked by Bacillus on endophytic bacterial community OTU of rice stem (Class level)(Venn analysis)

圖7 芽胞桿菌浸種對水稻葉部組織內生細菌物種的影響(Venn分析)Fig.7 Effect on species of bacterial endophytes in rice leaf sewed in Bacillus (Venn analysis)

3 討論

本研究通過高通量測序的方法檢測芽胞桿菌浸種后水稻不同組織內生細菌群落的多樣性,研究結果表明芽胞桿菌浸種后水稻根系和莖部內生細菌具有豐富的多樣性,葉部內生細菌多樣性明顯降低。水稻內生細菌群落包括可培養和不可培養內生菌,采用微生物純培養方法只能獲得部分內生細菌群落結構信息,大部分不可培養內生菌的信息無法在平板上獲得。近些年高通量測序技術因其自身的優點廣泛應用到微生物多樣性研究中[23-24]。

水稻組織內生細菌群落結構受品種基因型、栽培條件、氣候特點和土壤性質等多種因素的影響。本研究中,采用貝萊斯芽胞桿菌E69、解淀粉芽胞桿菌S170和短小芽胞桿菌S9對水稻品種G19浸種處理,種植20 d后水稻根系、莖部和葉部內生細菌群落的多樣性顯著變化。崔凱等[22]研究表明吡蟲啉、噻蟲嗪和苯醚甲環唑對水稻根系和葉部內生細菌群落的多樣性影響不顯著,但毒死蜱在低濃度的條件下對水稻根系內生細菌群落的多樣性影響明顯,在高濃度條件下抑制根系內生細菌群落多樣性。這與本研究結果差異較大,說明化學農藥與生防菌劑對水稻內生細菌群落的影響顯著不同,也說明地理環境、栽培條件、品種特性、藥劑噴施或者浸種都會影響水稻內生細菌群落的多樣性[25-26]。分析原因,芽胞桿菌一方面可能促進了水稻組織中一些內生細菌的生長,另一方面抑制了部分有害菌的生長。因此,導致了根系、莖部和葉部內生細菌群落多樣性發生變化。

已有的研究報道中,變形菌門、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門和厚壁菌門是水稻根系和莖部主要的細菌門。芽胞桿菌浸種處理后水稻根系和莖部內生細菌的優勢菌群是變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門,其中變形菌門的豐度沒有發生顯著變化,但是擬桿菌門的豐度明顯提高,厚壁菌門的豐度顯著降低,葉部內生細菌的優勢菌門是厚壁菌門。崔凱等[22]研究發現吡蟲啉、毒死蜱、噻蟲嗪和苯醚甲環唑施用后,水稻根系和葉部內生細菌的優勢菌群均是變形菌門。本研究采用Illumina MiSeq測序技術檢測出芽胞桿菌浸種后水稻根系的優勢菌屬是檸檬酸桿菌屬、金黃桿菌屬、腸桿菌屬、單胞菌屬和克雷伯菌屬。與清水對照的優勢菌屬差異較大,但是又有一些共有的優勢菌屬。但是由于種植在土壤中,土壤中一些優勢菌屬進入水稻根系,對根系內生細菌優勢菌屬影響較大,因此產生共有菌屬。芽胞桿菌浸種處理刺激了根系內一部分內生細菌的生長,產生了獨有的優勢菌屬。芽胞桿菌浸種后水稻莖部的優勢菌屬是假單胞菌屬、金黃桿菌屬、腸桿菌屬、單胞菌屬和叢毛單胞菌屬,根系中的部分內生細菌擴展到莖部組織成為優勢菌屬。芽胞桿菌浸種后水稻葉部的優勢菌屬是只有芽胞桿菌屬,豐度達到99.61%以上,其中短小芽胞桿菌S9浸種后葉部還有0.39%的假單胞菌屬。芽胞桿菌能夠在水稻組織中穩定定殖,而且吸收寄主營養,不斷在水稻植株體內繁殖,最終葉片內接種芽胞桿菌菌株數量遠遠超過其他菌屬,成為了葉部的優勢菌群,導致葉部內生細菌群落多樣性較低。另外,測序樣本是水稻種植后20 d,此時葉片內菌屬的豐度普遍較低,接種芽胞桿菌也會抑制部分內生細菌的生長。據推測,測序樣本如果是水稻孕穗期,有可能葉片內生細菌種類會比較豐富。在實踐證明,芽胞桿菌屬的細菌廣泛具有防病促生效果[27-28],本研究說明芽胞桿菌浸種處理可以提高水稻葉部的抗性。本研究只檢測了芽胞桿菌浸種對水稻內生細菌群落多樣性的影響,未檢測對內生真菌和內生放線菌群落多樣性的影響,需要將三項檢測結果結合起來進一步剖析芽胞桿菌浸種對水稻品種抗性的影響。

化學農藥的殘留不僅容易污染生態環境和威脅人類健康[29],對水稻內生細菌群落具有一定抑制作用[22,26]。本研究中的芽胞桿菌通過實驗室研究和田間試驗證實對水稻稻瘟病具有較明顯的生防效果,而且對生態環境沒有污染。本研究結果也說明貝萊斯芽胞桿菌E69、解淀粉芽胞桿菌S170和短小芽胞桿菌S9可以在水稻產業可持續發展中推廣應用。

4 結論

芽胞桿菌浸種可以顯著增加水稻根系和莖部內生細菌群落的豐富度和均勻度,降低葉部的豐富度和均勻度；顯著提高水稻根系內生細菌群落的多樣性,對莖部和葉部的多樣性沒有顯著影響。芽胞桿菌浸種后,水稻G19根系和莖部的變形菌門豐度沒有顯著變化,擬桿菌門的豐度顯著增加,厚壁菌門的豐度顯著降低。浸種后根系獨有的優勢菌屬是檸檬酸桿菌屬、金黃桿菌屬和克雷伯菌屬,莖部獨有的優勢菌屬是金黃桿菌屬、單胞菌屬和叢毛單胞菌屬,葉部內生細菌優勢菌群是厚壁菌門(99.61%以上)和芽胞桿菌屬(99.64%以上)。試驗結果表明芽胞桿菌浸種可以顯著增加水稻根、莖和葉中芽胞桿菌屬的豐度。因此,芽胞桿菌浸種處理可以在水稻產業可持續發展中推廣應用。