一株馬鈴薯黑痣病生防菌的篩選及發酵條件優化

程永樂 路曉培 蔣瑩 李國光 陳有君 霍烽 李立民

摘要?采用平板對峙法從土壤中篩選并鑒定一株馬鈴薯黑痣病的生防菌，并對該菌株發酵培養基和發酵條件進行了優化。結果顯示，H13菌株的最優培養基組成：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L，葡萄糖8 g/L，蔗糖6 g/L，干酪素6 g/L，硫酸鎂1 g/L;最佳培養條件為初始pH 7.2，發酵時間35 h，接種量300 μL種子液，轉速180 r/min，發酵溫度28 ℃。

關鍵詞?生防菌;發酵條件;培養基

中圖分類號?S?435.42文獻標識碼?A

文章編號?0517-6611（2019）23-0153-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.23.044

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Screening of an Antagonistic Strain of Potato Black Nevoid Disease and Optimization of Fermentation Conditions

CHENG Yong?le，LU Xiao?pei，JIANG Ying et al

（College of Life Sciences， Inner Mongolia Agricultural University， Hohhot， Inner Mongolia 010018）

Abstract?A biocontrol strain of potato black nevoid disease was screened and identified by plate confrontation method， and the fermentation medium and fermentation conditions of the strain were optimized. The results showed that the optimum culture medium of strain H13 was tryptone 10 g/L， yeast extract 5 g/L， sodium chloride 10 g/L， glucose 8 g/L， sucrose 6 g/L， casein 6 g/L， magnesium sulfate 1 g/L. The optimum culture conditions were as follow： the initial pH value of 7.2， the fermentation time of 35 h， the inoculum size of 300 μL seed solution， the rotating speed of 180 r/min， and the fermentation temperature of 28 ℃.

Key words?Biocontrol bacteria; Fermentation conditions;Culture medium

馬鈴薯黑痣病是由立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）引起的一種土傳性真菌病害，該病害既可通過土壤傳播，也可通過帶病種薯傳播[1]，在世界各國馬鈴薯主產區均普遍發生，嚴重影響馬鈴薯的產量和品質[2]。目前，馬鈴薯黑痣病主要以化學防治為主，但化學農藥污染環境，破壞生態，對食品安全產生了嚴重影響，因此篩選馬鈴薯土傳病的生防菌防治馬鈴薯黑痣病是有效途徑之一，且生防菌對生態、人類健康和環境安全[3]。筆者采用平板對峙法從土壤中篩選并鑒定一株馬鈴薯黑痣病的生防菌，并對該菌株發酵培養基和發酵條件進行了優化。

1?材料與方法

1.1?菌株的分離與鑒定

利用分離芽孢桿菌的方法[4]分離菌株，用平板對峙法篩選具有拮抗效果的菌株，參考文獻[5]擴增16S rRNA基因，PCR產物送至北京博邁德生物有限公司進行測序。

1.2?初始發酵培養基的篩選

選擇5種不同的發酵培養基，分別是1/2 R2A培養基、MS培養基、馬丁培養基、高氏一號培養基、LB培養基，接種200 μL H13種子液，在28 ℃、160 r/min條件下培養40 h，測定發酵液的OD600，每種發酵培養基3次重復。

1.3?碳源、氮源、無機鹽的確定

分別加入濃度為0.2%、04%、0.6%、0.8%、1.0%的麥芽糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、葡萄糖、蛋白胨、干酪素、硫酸銨和磷酸氫二胺接種至50/100 mL三角瓶，加入濃度為0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%硫酸鎂、碳酸鈣和磷酸氫二鉀接種至50/100 mL三角瓶，確定最優碳源、氮源、無機鹽。

1.4?發酵培養基的優化

將篩選后得到的最佳碳源、氮源、無機鹽3個重要的培養因素按照正交試驗[6-8]L9（34）設計，pH為7.0，在28 ℃、160 r/min振蕩培養40 h，以OD600作為指標考察4因素3水平對發酵培養基的影響，從而確定最佳培養基配方。

1.5?發酵條件的優化

以優化的培養基為發酵培養基，分別測定不同發酵時間初始pH（4.3、5.5、5.8、7.2、7.7、8.0、86和9.2）、發酵溫度（20、25、28、30、35、40 ℃）、發酵時間（10、20、30、40、50、60、70 h）、搖床轉速（150、160、180、210、230 r/min）、初始接種量（50、100、150、200、250、300、350 μL），對H13菌株OD600的影響，以初始條件為基礎，每一因素的優化均在前一因素優化的基礎上進行。

綜上所述，H13的碳源為蔗糖和葡萄糖，最佳氮源為干酪素，最佳無機鹽為硫酸鎂;結合單因素試驗結果進行正交試驗，結果顯示胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L，葡萄糖8 g/L，蔗糖6 g/L，干酪素6 g/L，硫酸鎂1 g/L;最佳培養條件為初始pH 7.2，發酵溫度28 ℃，發酵時間35 h，轉速180 r/min，接種量300 μL。

參考文獻

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