方敏敏 王翠麗

摘要?為了明確17α，20β雙羥孕酮（DHP）及其核受體調(diào)控促性腺激素釋放激素mRNA在雄性斑馬魚腦組織中的表達機制，采用實時熒光定量PCR方法、類固醇激素活體和離體暴露方法進行試驗。結(jié)果表明，野生型雄性斑馬魚活體暴露于100 nmol/L DHP水溶液，伴隨暴露時間的延長，gnrh2和gnrh3 mRNA表達量呈逐漸升高趨勢，24 h出現(xiàn)表達最高峰;野生型雄性斑馬魚活體分別暴露于10和100 nmol/L DHP水溶液24 h。與對照組相比，100 nmol/L DHP試驗組gnrh2和gnrh3 mRNA表達量升高，差異顯著（P<0.05），而10 nmol/L DHP試驗組無顯著變化（P>0.05）;野生型雄性斑馬魚活體暴露于100 nmol/L DHP與100 nmol/L RU486混合水溶液24 h，試驗組gnrh2和gnrh3 mRNA表達量與對照組相比無顯著變化（P>0.05）;野生型和孕酮核受體敲除型（pgr-/-）雄性斑馬魚活體分別暴露于100 nmol/L DHP水溶液24 h，與野生型試驗組相比pgr-/-型試驗組gnrh2和gnrh3 mRNA表達量顯著降低（P<0.05）;野生型和pgr-/-型雄性斑馬魚腦組織離體暴露于含100 nmol/L DHP的L-15培養(yǎng)液24 h，與野生型試驗組相比pgr-/-型試驗組gnrh2和gnrh3 mRNA表達量顯著降低（P<0.05）。由此可見，DHP與核受體結(jié)合可直接調(diào)控雄性斑馬魚腦組織中促性腺激素釋放激素gnrh2和gnrh3 mRNA表達。

關(guān)鍵詞?斑馬魚;17α，20β雙羥孕酮;孕酮核受體;促性腺激素釋放激素

中圖分類號?S?917文獻標(biāo)識碼?A

文章編號?0517-6611（2019）23-0099-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.23.029

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

mRNA Expression of Gonadotropin?releasing Hormone in Zebrafish Induced by DHP and Its Nuclear Receptor

FANG Min?min1，2， WANG Cui?li1，2

（1.Institute of Geography and Oceanography， Nanning Normal University， Nanning，Guangxi530000;2. Key Laboratory of Environment Change and Resources Use in Beibu Gulf， Nanning Normal University， Nanning，Guangxi530000）

Abstract?In order to clarify that 17α，20β dihydroxyproterone （DHP） and its nuclear receptorregulated expression mechanism of gonadotropin?releasing hormone （GnRH） mRNA in male zebrafish，real?time PCR， steroid hormone exposure in vivo and in vitro were used in this test. The results showed that it took 24 h for gnrh2 and 24 h for gnrh3 to respond significantly （P<0.05）. 24 h 100 nmol/LDHP exposure significantly increased the expression of gnrh2 and gnrh3 mRNA （P<0.05）.

With and without DHP in vivo treatment， compared with wild type zebrafish treatment group， mRNA expressions of gnrh2 and gnrh3 were significantly decreased in pgr-/- zebrafish treatment group （P < 0.05）， while that in wild?type zebrafish and pgr-/- zebrafish brain tissue were all exposed to L?15 culture medium containing 100 nmol/L DHP for 24 h， compared with wild?type zebrafish treatment group， mRNA expressions of gnrh2 and gnrh3 were significantly decreased in pgr-/- zebrafish treatment group （P < 0.05）. DHP and its nuclear receptors could regulate mRNA expressions of gonadotropin?releasing hormone in male zebrafish.

Key words?Zebrafish;17α，20β?dihydroxy?4?pregnen?3?one;Nuclear progesterone receptor;Gonadotropin?releasing hormone

17α，20β雙羥孕酮（DHP）是魚類精巢所特有的調(diào)控生殖系統(tǒng)的暫時性孕激素[1]，在雄魚精原細胞增殖分化期，血清中DHP的水平會出現(xiàn)一個短暫和顯著的升高過程[2-3]，這不僅對誘導(dǎo)B型精原細胞分化為初級精母細胞起決定作用[4]，而且對精子成熟、排精并獲能也起到重要的作用[5-6]。Wang等[7]研究表明DHP、孕酮核受體和促性腺激素釋放激素（gonadotropin?releasing hormone，GnRH）共同參與調(diào)控促性腺激素（gonadotropins hormone，GTH）mRNA表達，進而調(diào)控雄魚生殖周期。

哺乳動物下丘腦分泌的促性腺激素釋放激素可通過脈沖形式進入垂體門脈系統(tǒng)，并與垂體中的受體結(jié)合促使垂體產(chǎn)生促性腺激素并對生殖起到重要的調(diào)控作用[8-12]。魚類的相關(guān)研究已表明，魚類雖缺少垂體門脈系統(tǒng)，但腦組織中促性腺激素釋放激素在調(diào)控垂體促性腺激素產(chǎn)生、性腺組織發(fā)育和性成熟中仍起至關(guān)重要的作用[13]。筆者以雄性斑馬魚為研究對象，研究雄性斑馬魚在DHP及其核受體的調(diào)控作用下下丘腦組織中促性腺激素釋放激素2（gonadotropin?releasing hormone 2，GnRH2）和促性腺激素釋放激素3（gonadotropin?releasing hormone 3，GnRH3）mRNA表達的變化規(guī)律，探索其在腦組織中的信號調(diào)控通路，以期豐富DHP及其核受體在雄魚生殖內(nèi)分泌中的作用機理。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?試驗動物。

共用72尾野生型（WT）圖賓根家系（Tüebingen）成年（3～4月齡）雄性斑馬魚、6尾孕酮核受體敲除型（pgr-/-）成年（3～4月齡）雄性斑馬魚，孕酮核受體基因敲除方法詳見參考文獻[14]。試驗動物飼養(yǎng)條件如下：室內(nèi)恒溫28 ℃;光照14 h（08：00—22：00），非光照10 h（22：00—次日08：00）;水體為紫外滅菌處理的去離子循環(huán)水，pH 7.2～7.6;成年斑馬魚每天早上（08：30—09：00）、中午（12：00—12：30）和傍晚（18：30—19：00）各投喂熱帶魚食3次，飼養(yǎng)條件詳見參考文獻[15]。

1.1.2?藥品。

間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽（MS-222）、17α，20β雙羥孕酮（DHP）、米服司酮（RU486）購自Sigma公司。

1.1.3?主要試劑。

RNAzol試劑，購自MRC公司;SYBR Select Master Mix試劑盒，購自ABI公司;QIAquick Gel Extraction 試劑盒，購自QIAGEN公司;rTaq酶、10×PCR Buffer、2.5 mmol/L dNTP、DNA Marker、PMD19-T克隆載體，均購自TaKaRa公司;DH5α感受態(tài)細胞、X-gal，購自北京全式金公司;L-15粉末，購自GIBCO公司;瓊脂糖、DEPC、Hepes、D-Hank緩沖液、青霉素、鏈霉素，均購自Solarbio公司;引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.1.4?主要儀器。

電泳儀（型號為Powerpac HV 164-5056），購自Bio-Rad公司;超微量紫外分光光度計（型號為NanoDrop-1000），購自NanoDrop公司;全自動凝膠成像系統(tǒng)（型號為Syngene Genius），購自Syngene公司;低溫恒溫槽（型號為DC-1006），購自無錫沃信儀器有限公司;梯度熱循環(huán)儀（型號為T100），購自Bio-Rad公司;熒光定量PCR儀（型號為7500FAST），購自ABI公司;高速離心機（型號為5810R），購自Eppendorf公司;體視顯微鏡（型號為CX22），購自O(shè)lympus公司;多功能顯微鏡（型號為BX51），購自O(shè)lympus公司;離心機（型號為MiniSpin plus），購自Eppendorf公司。

1.2?方法

1.2.1?野生型雄性斑馬魚DHP活體暴露時間效應(yīng)。

13：00隨機取30尾活體野生型雄性斑馬魚放入暴露魚缸（4 L）中，加入DHP，使水體中DHP終濃度為100 nmol/L，每次取樣6尾，暴露0、3、6、12和24 h取樣，用MS-222溶液麻醉，解剖取腦組織置于液氮中速凍，-80 ℃下保存，用于gnrh2和gnrh3基因mRNA相對表達分析。

1.2.2?野生型雄性斑馬魚DHP活體暴露劑量效應(yīng)。

13：00隨機取18尾活體野生型雄性斑馬魚放入3個暴露魚缸（4 L）中，加入DHP，使水體中DHP終濃度分別為0、10和100 nmol/L，連續(xù)暴露24 h后，用MS-222溶液麻醉，解剖取腦組織置于液氮中速凍，-80 ℃下保存，用于gnrh2和gnrh3基因mRNA相對表達分析。

1.2.3?野生型雄性斑馬魚活體DHP和RU486暴露。

13：00隨機取12尾活體野生型雄性斑馬魚放入2個暴露魚缸（4 L）中，加入DHP和RU486，使水體中類固醇終濃度分別為0 nmol/L（DHP）+0 nmol/L（RU486）、100 nmol/L（DHP）+100 nmol/L（RU486），連續(xù)暴露24 h，用MS-222溶液麻醉，解剖取腦組織置于液氮中速凍，-80 ℃下保存，用于gnrh2和gnrh3基因mRNA相對表達分析。

1.2.4?野生型和孕酮核受體敲除型雄性斑馬魚DHP活體暴露。

13：00隨機取6尾活體野生型和6尾活體孕酮核受體敲除型（pgr-/-）雄性斑馬魚放入2個暴露魚缸（4 L）中，分別加入DHP，使水體中DHP終濃度為100 nmol/L，連續(xù)暴露24 h，用MS-222溶液麻醉，解剖取腦組織置于液氮中速凍，-80 ℃保存，用于gnrh2和gnrh3基因mRNA相對表達分析。

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