基于網絡藥理學探討葛酮通絡膠囊緩解缺血性腦卒中機制

楊紅 張威 安太健 王慶峰

摘要：目的 ?采用網絡藥理學方法探討葛酮通絡膠囊緩解缺血性腦卒中（ICA）的機制。方法 ?依托DisGeNET數據庫構建ICA背景網絡，通過中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（TCMSP）及TCM Database檢索葛根中的黃酮類化合物，獲得其相應靶點，并對ICA進行打靶處理，獲得作用靶點，進而構建蛋白質相互作用網絡及化合物-靶點-通路網絡，據此分析葛酮通絡膠囊緩解ICA的機制。結果 ?獲得葛根黃酮化合物9個，其對應靶點321個，ICA靶點共393個。葛根的黃酮化合物共有48個為其藥物作用的直接靶點，平均節點度為30.8，核心蛋白相互作用網絡中22個靶點的節點度大于平均節點度。葛酮通絡膠囊改善ICA的主要KEGG通路為血液流體及動脈粥樣硬化、核因子-κB、腫瘤壞死因子等，并廣泛參與調節血液代謝如調節血壓、調節脂代謝過程、調節細胞凋亡等生物過程。結論 ?本研究初步驗證了葛酮通絡膠囊緩解ICA的靶點及作用方式，可為進一步揭示其作用機制奠定基礎。

關鍵詞：葛酮通絡膠囊;缺血性腦卒中;網絡藥理學;分子靶點;作用機制

中圖分類號：R277.733;R2-05 ???文獻標識碼：A ???文章編號：1005-5304（2019）12-0084-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.12.018 ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Discussion on Mechanism of Getong Tongluo?Capsules in Relieving Ischemic Stroke Based on Network Pharmacology

YANG Hong¹， ZHANG Wei¹， AN Taijian¹，?WANG Qingfeng²

1. Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Shenyang 110032， China; 2. Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Shenyang 110032， China

Abstract：?Objective To explore the mechanism of Getong Tongluo Capsules in relieving ischemic stroke （ICA）?through network pharmacology. Methods The background network of ICA was constructed based on DisGeNET database， and the flavonoids in Puerariae Lobatae Radix?were retrieved by TCMSP and TCM database to obtain their corresponding targets. The ICA were targeted with the above targets， and the target of its action was obtained， and then a protein interaction network and a compound-target-path network were constructed. Finally， the mechanism of Getong Tongluo Capsules in alleviating ICA was analyzed. Results There were 9 flavonoids in Puerariae Lobatae Radix， with 321 corresponding targets， and 393 ICA targets. There were 48 flavonoids in Puerariae Lobatae Radix as the direct targets of drug action， with an average node degree of 30.8， while 22 targets were larger than the average node degree?in the core PPI network. The main KEGG pathways of Getong Tongluo Capsules in improving ICA symptoms were blood fluids and atherosclerosis， NF-κB and TNF. Getong Tongluo Capsules were more widely involved in regulating blood metabolism， such as blood pressure regulation， lipid metabolism and apoptosis. Conclusion The results of this study preliminarily validate the target and mode of Getong Tongluo?Capsules in alleviating ICA， and lay a foundation for further revealing its mechanism of action.

Keywords：Getong TongluoCapsules; ischemic stroke; network pharmacology; molecular targets; mechanism of action

缺血性腦卒中（ischemic cerebralvascular accident，ICA）是臨床常見的急性腦血管疾病。在ICA治療過程中，除溶栓、抗凝及神經保護等藥物外，還可聯用中藥^[1-2]。已有研究表明，葛酮通絡膠囊用于治療腦卒中療效良好^[3-5]。葛酮通絡膠囊主要成分為葛根總黃酮，功效活血化瘀，用于缺血性中風中經絡恢復期瘀血痹阻脈絡證，癥見半身不遂、口舌歪斜、偏身麻木、語言不利、頭暈目眩、頸項強痛等。目前針對葛酮通絡膠囊的研究多集中于臨床，其機制研究相對較少。本研究采用網絡藥理學方法，構建中藥成分-靶標-信號通路復雜網絡，分析葛酮通絡膠囊有效成分作用于ICA的主要靶點，以期闡明其分子調控機制。

1 ?資料與方法

1.1 ?藥物有效成分篩選

葛酮通絡膠囊的主要成分為葛根總黃酮提取物。通過檢索中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），得到葛根的已知化合物，獲取其中的黃酮類化合物，即為葛酮通絡膠囊的有效成分。

1.2 ?口服生物利用度預測

口服生物利用度（OB）指藥物在人體循環系統的吸收情況，并以吸收、分布、代謝、排泄（ADME）藥代動力學參數評價藥物的口服吸收活性。本研究根據TCMSP中的OBioavail模型^[7]評價藥物的吸收特性，并基于此獲得葛酮通絡膠囊黃酮類成分的OB值。

1.3 ?藥物有效成分和疾病靶點收集

在Drugbank數據庫（http：//www.drugbank.ca）中找出葛酮通絡膠囊有效成分所作用的分子靶點。檢索DisGeNET數據庫（http：//www.disgenet.org），以“Ischemic Cerebrovascular Accident”（№.C0948008）為關鍵詞，獲得ICA調控的分子靶點。以String構建上述分子靶點對應的網絡數據庫。

1.4 ?網絡構建與分析

采用Cytoscape3.7.1軟件，以ICA的String數據為基礎，構建ICA調控的蛋白質相互作用網絡，再以葛酮通絡膠囊有效成分作用的分子靶點對該網絡進行打靶處理，獲得其對應的直接調控靶點及其所涉及的相關調控網絡。通過Cytoscape3.7.1軟件網絡分析功能對該網絡進行拓撲學運算，獲得該藥物-靶標網絡的分布特性。為確定葛酮通絡膠囊有效成分對目標蛋白質相互作用網絡的調控作用，以藥物與疾病重疊靶點的String數據為基礎構建背景網絡，再引入藥物的化合物-靶點網絡，獲得化合物-蛋白質相互作用網絡。采用Cytoscape3.7.1軟件cluster maker2插件對網絡特性進行聚類分析，采用其clueGO插件對關鍵分子靶點的基因功能（GO）和相關通路進行富集分析。

2 ?方法與結果

2.1 ?藥物有效成分及其靶點

從TCMSP共獲取葛根的已知化合物18種，其中黃酮類化合物共9種，其OB值為11.52%～69.67%，類藥指數（DL）為0.19～0.78，見表1。在Drugbank數據庫中找出9個有效成分所作用的分子靶點共321個，經降重處理，獲得葛酮通絡膠囊有效成分作用的分子靶點共190個。

2.2 ?藥物-疾病作用網絡構建與分析

通過DisGeNET數據庫獲得ICA調控的分子靶點共393個（Summary模式）。以葛酮通絡膠囊作用的分子靶點對ICA調控的蛋白質相互作用網絡進行打靶，獲得重疊的分子靶點共48個。

進一步根據ICA蛋白質相互作用網絡特征，獲得與直接靶點調控較為密切的間接靶點，所得網絡形態見圖1。根據該網絡的拓撲結構可知，網絡內的節點共311個，對應的邊共4755條，平均節點度為30.8，共有113個節點大于平均節點度。

以48個直接靶點對葛酮通絡膠囊的化合物-分子靶點背景網絡進行打靶處理，獲得藥物的化合物-靶點網絡，見圖2。

可以看出，在已獲得的9個黃酮類化合物中，大豆苷-4，7-二葡糖苷（daidzein-4，7- diglucoside）無法直接對ICA的相關網絡進行調控，故后續研究及網絡構建中不引入大豆苷-4，7-二葡糖苷所涉及的調控靶點分子。

葛酮通絡膠囊有效成分對目標蛋白相互作用網絡聚類分析結果見圖3。

對該網絡的拓撲結構（剔除化合物節點）分析可知，網絡節點共311個，對應530條邊，平均節點度為19.32。該網絡可以確定為葛酮通絡膠囊緩解ICA的核心蛋白相互作用網絡。對圖3靶點分子的節點度進行排序，結果見圖4。48個靶點中，大于平均節點度的靶點共22個，分別為IL6、PTGS2、VEGFA、NOS3、PPARG、MMP9、TP53、CXCL8、IL1B、ESR1、ICAM1、VCAM1、MMP2、MAPK1、IGF1、KDR、F2、IL4、TGFB1、AGTR1、AR和SELP。可確定上述分子靶點是葛酮通絡膠囊緩解ICA的核心調控分子。

2.3 ?基于藥物作用靶點的功能預測

為進一步考察葛酮通絡膠囊緩解ICA的作用方式及效果，對獲得的22個關鍵分子靶點功能進行分析。經clueGO插件分析，獲得葛酮通絡膠囊的富集功能，見圖5、圖6。去除其中與ICA無關的通路（如膠質瘤、黑色素瘤、前列腺癌等），取P≤0.01，獲得葛酮通絡膠囊緩解ICA的主要KEGG通路，包括血液流體及動脈粥樣硬化（Fluid shear stress and atherosclerosis，FssAs）、核因子-κB（NF-κB）、腫瘤壞死因子（TNF）及松弛素（Relaxin）等通路。取P≤0.000 1，獲得調控的相關生物過程（GO-BP），其可通過對關鍵分子靶點的調控，實現對血管平滑肌（regulation of blood vessel endothelial cell migration）、一氧化氮代謝（positive regulation of reactive oxygen species metabolic process）、生成血管內皮生長因子（regulation of vascular endothelial growth factor production）等生物過程的調控。

3 ?討論

葛酮通絡膠囊于1995年收入《中華人民共和國藥典》，但針對該藥的研究相對落后，仍然以臨床療效^[8-9]或質量標準^[10-11]為主，而對其機制研究不夠深入，極大限制了該藥進一步的臨床應用。本研究依托TCMSP構建該藥的化合物-靶點網絡，再應用DisGeNET數據庫構建ICA的背景網絡，經打靶處理，確定了葛酮通絡膠囊的化合物-靶點-疾病靶點的相互作用關系，為考察藥物的治療機制提供參考。

由圖2可知，染料木黃酮、大豆苷元和葛根素為整個藥物的關鍵化合物，其節點度遠高于其他化合物，可推測上述3個化合物在藥物治療中發揮關鍵作用。基于染料木黃酮、大豆苷元的OB值及DL值低于葛根素（見表1），可以確定，葛根素是葛酮通絡膠囊最重要的有效成分。研究表明，葛根素有良好的抗缺血再灌注的藥理活性，可有效改善腎臟、心臟及腦的缺血再灌注癥狀^[12-14]。另外，大豆苷元^[15]、染料木黃酮^[16]、芒柄花黃素^[17]等也被臨床及基礎研究顯示有較好的改善腦缺血再灌注的藥理學活性。因此，葛酮通絡膠囊緩解ICA是一個多成分、多靶點、多途徑的過程。

由圖4可知，葛酮通絡膠囊參與了ICA相關大量分子靶點的調控。而這些靶點在ICA的發病過程中介導不同的生物學功能。隨著腦缺血發生，小膠質細胞活化，并激活其對應經典激活（M1）及選擇激活（M2）表型。其中，M1可激活NFKB通路，該通路上的白細胞介素（IL）-1及基質金屬蛋白酶（MMP）-9開始釋放，加重腦部損傷^[18];IL-4則隨M2的細胞激活而產生，從而抑制炎癥反應，保護腦組織^[19]。隨著腦部缺血，腦組織內的星形膠質細胞亦會直接釋放多種促炎癥因子，進而誘導一氧化氮合酶（NOS）過表達，促進反應性膠質增生和膠質瘢痕形成^[20]。除直接調控腦組織的細胞活化外，葛酮通絡膠囊的分子靶點還包括細胞黏附分子（ICAM）及趨化因子所涉及的炎癥反應。腦部缺血會上調ICAM表達，導致細胞間的黏附，誘導炎癥反應;此時，內皮細胞表面的選擇素-P及選擇素-E會募集血液中白細胞，并通過ICAM1結合于血管內皮表面，再使其分泌的水解酶直接破壞組織損傷區的血管壁^[21]。腦部缺血也會上調趨化因子（CXC）的表達，維持炎癥反應及組織損傷區的炎癥通路。Villa等^[22]研究顯示，通過對IL-8/CXCL8的抑制，腦部損傷面積顯著縮小，且腦部的炎癥反應隨之減輕。ICA可直接改變腦組織的血腦屏障通透性，特別是損傷區域，由于ICAM及CXC的持續炎癥作用，血腦屏障的通透性增加會持續長達損傷后7 d，這也開啟了大量炎性細胞進入損傷區域的通道。因此，降低血腦屏障通透性可保護ICA帶來的腦組織損傷，葛酮通絡膠囊可通過對MMP的調控發揮該作用。MMP是腫瘤研究中的關鍵靶點分子， MMP過表達導致細胞外基質不斷降解，增加血腦屏障通透性。以往研究顯示，MMP-9隨著ICA的發病而過表達，且與腦梗死面積、神經功能缺損程度呈正相關^[23-24]。本研究顯示，除炎癥反應外，葛酮通絡膠囊還可改善ICA的血管重構，如調控血管內皮生長因子（VEGF）及Relaxin信號通路上的靶點分子誘導內皮型一氧化氮^[25]及VEGFA^[26]等。其生物過程包括：①調控血管平滑肌的增殖過程（IL-6、TSF1）;②調控血管內皮細胞的遷移（TGR、TGFB1）;③調節VEGF的產生（IL-1B、TGFB1）。

根據功能富集結果可知，葛酮通絡膠囊主要調控的KEGG通路包括FssAs、炎癥反應（如NF-κB和TNF）、Relaxin信號通路等。通過對炎癥反應的通路調控，改善ICA所致的血腦屏障破壞、腦水腫等炎癥浸潤;通過對FssAs、Relaxin通路調控，緩解ICA血管重構所致的腦部缺氧去極化、氧自由基損傷及腦部細胞凋亡。GO-BP富集結果表明，葛酮通絡膠囊可有效調節血管平滑肌及氧代謝過程。對葛酮通絡膠囊的功能富集分析表明，可有效理清其緩解ICA的主要路徑及方式。葛酮通絡膠囊通過對靶點的調控，影響其對應的表型/通路，從而緩解ICA。

綜上所述，本研究應用網絡藥理學方法，對葛酮通絡膠囊多成分、多靶點、多途徑的復雜網狀關系進行研究，結果初步驗證了葛酮通絡膠囊緩解ICA的相關機制，并為進一步深入探討其作用機制奠定基礎。

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（收稿日期：2019-02-18）

（修回日期：2019-03-15;編輯：陳靜）