新時代高清晰度不同術中冰凍染色流程比較研究

黎濟榮 楊曉勇 陽練

[摘要] 目的 探尋適合新時代要求的高清晰度術中冰凍染色流程，并對現存的不同術中冰凍染色流程進行比較研究。方法 2016年10月8日臨床送檢手術標本，同一塊組織按照1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm取材5塊，隨機分配為微波爐加熱組、酒精燈加熱組、恒溫箱加熱組、全自動染色機組、電吹風加熱組。每組按標準術中冰凍流程制備100張冰凍病理切片，蘇木素染色環節按分組方式各干預2 min，以標準石蠟制片為參照，觀察各組冰凍切片組織結構及細胞特征的清晰度差異，按A、B、C、D類片予分類計數并進行統計學處理。 結果 A類片與標準石蠟HE制片效果基本一致，具有檢驗意義。微波爐加熱組A類片占總構成比的56.6%，恒溫箱加熱組A類片占14.7%，酒精燈加熱組A類片占13.2%，全自動染色機組A類片占8.5%，電吹風加熱組A類片占7.0%。微波爐加熱組A類片顯著高于其他組，差異具有統計學意義（P<0.05）。高清晰度術中冰凍制片以微光波技術為基礎，完善了染色流程及技術模式。 結論 高清晰度術中冰凍染色流程實際制片效果與標準石蠟切片基本一致，技術流程規范嚴謹，技術模式系統完整，制片質量穩定可靠，經得起重復試驗驗證，具有鮮明的新時代特色。

[關鍵詞] 術中冰凍;染色;高清晰度;微光波技術

[中圖分類號] R736.1 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-9701（2019）30-0038-04

Comparative study on different high-definition intraoperative frozen staining processes suitable for new era

LI Jirong ? YANG Xiaoyong ? YANG Lian

Department of Medical Education， Yongchuan Hospital of Traditional Chinese Medicine of Chongqing Medical University， Chongqing ? 402160， China

[Abstract] Objective To explore the high-definition intraoperative frozen staining processes suitable for the new era， and to compare the different existing intraoperative frozen staining processes. Methods On October 8， 2016， of the surgical specimens sent for clinical examination， 5 pieces with the size of 1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm were taken from the same piece of tissue and randomly assigned to microwave heating group， alcohol lamp heating group， incubator heating group， full automatic staining machine group and hair dryer heating group. In each group， 100 frozen pathological slices were prepared according to the standard intraoperative freezon process and each group was intervened for 2 minutes with hematoxylin staining. With the standard paraffin slice as reference， the definition differences in the tissue structures and cell characteristics of the frozen slices of each group were observed. The slices were classified into class A， B， C and D， and were calculated and processed statistically. Results The preparation effect of the class A slice was basically the same as that of the standard paraffin HE slice， with statistical significance. In the microwave heating group， class A slices accounted for 56.6% of the total， in incubator heating group， class A slices accounted for 14.7%， in alcohol lamp heating group， class A slices accounted for 13.2%， in full automatic staining unit group， class A slices accounted for 8.5%， and in hair dryer heating group， class A slices accounted for 7.0%. The number of class A slices in microwave heating group were significantly higher than that in other groups， with statistically significant differences （P<0.005）. High-definition intraoperative frozen slice was based on micro-lightwave technology， which improved the staining process and the technical mode. Conclusion The high-definition intraoperative frozen staining process has consistent slice preparation effect with the standard paraffin slice， of which the technical process specification is rigorous， the technical mode system is complete， the production quality is stable and reliable， and it can withstand repeated test verification and has a distinct feature of new era.

[Key words] Intraoperative frozen; Staining; High definition; Micro-lightwave technology

新時代需要高清晰度術中冰凍病理切片[1]。到目前為止國內大多數病理科的術中冰凍病理切片在展示組織結構及細胞特征上清晰度確實不高，常常因此對術中冰凍病理診斷造成較大的識別困擾和診斷風險[2]。為此筆者于多家大型教學醫院進修學習，觀察到各大醫院在術中冰凍染色流程上基本一致，但在一些關鍵細節上有差異，如蘇木素染色環節[3]。有的病理科術中冰凍病理制片時此環節使用酒精燈加熱[4]，常規石蠟制片時使用微波爐加熱[5];有的病理科為全自動術中冰凍染色機制片，此環節未加熱[6];有的病理科此環節使用恒溫箱加熱[7];有的病理科此環節使用電吹風加熱[8]。為了切實比較上述制片效果的差異，筆者對不同術中冰凍染色流程的全部技術細節反復實驗測量，包括使用試劑的品種、濃度、作用時間、可能的作用機制等，并按蘇木素染色的不同干預方式各制備100張相關病理切片。結果顯示蘇木素染色環節使用微光波干預的一組制片效果最好，清晰度最高，展示的組織結構及細胞特征與標準石蠟制片效果接近，除部分含水量大的疏松組織因冰晶破壞致制片質量下降[9]。筆者圍繞該發現對相關染色流程及技術細節做了全面系統的探索和試驗，并作了大量文獻復習。

1 材料與方法

1.1 一般材料

實驗時間：2016年10月8日;標本來源：當天臨床送檢的術中活檢標本，標本信息核對無誤后立即取材，取材時認準典型病變部位[10]。各標本（乳腺癌1例、纖維瘤1例、子宮肌瘤1例、腦1例、腎1例）同一塊組織按照1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm取材5塊。隨機分配給微波爐加熱組、酒精燈加熱組、恒溫箱加熱組、全自動染色機組、電吹風加熱組， 每組按標準流程制備100張冰凍病理切片，蘇木素染色按各組方式干預2 min，以標準石蠟制片為參照，觀察各組冰凍病理切片組織結構及細胞特征的清晰度差異。

本次試驗采用自身配對設計，前瞻性統計研究，為第一次臨床病理試驗。嚴格控制非試驗因素，如試劑濃度、作用時間、切片厚度等計量資料。試驗切片按中華醫學會病理質控中心標準盡量做到[11]：①冰凍組織切面完整;②冰凍切片厚度3～5 μm;③冰凍切片無刀痕、裂痕、顫痕;④冰凍切片平坦、無皺褶折疊;⑤冰凍切片無污染;⑥冰凍切片無氣泡;⑦冰凍切片透明度好;⑧細胞膜、細胞質與細胞核染色對比清晰;⑨冰凍切片無松散、粘貼位置適當;⑩冰凍切片整潔，標簽端正粘牢、編號清晰。

1.1.1 納入標準[12] ?①當天送檢術中活檢組織;②標本送檢時間≤60 min;③標本未受任何污染;④標本未經任何試劑固定;⑤標本無任何溶解現象;⑥控制非試驗因素，統一標準制片流程;⑦切片評分≥90分（甲級片）;⑧均為首次發病;⑨簽署“知情同意書”;⑩醫院倫理委員會批準。

1.1.2 排除標準[12] ?①非當天送檢術中活檢組織;②標本送檢時間>60 min;③標本受到污染;④標本已被試劑固定;⑤標本有溶解現象;⑥制片操作未達到標準;⑦切片評分<90分;⑧不愿意配合者;⑨接受過化療者;⑩預測生存期低于3個月者。

1.2主要實驗設備與材料

微波爐（美的EM720KG1-PW）、1L塑料染色杯（微波爐可用）、冰凍切片機（LEICA-CM1950）、冰凍專用刀片（LEICA 819）、冰凍標本包埋劑、95%乙醇、蘇木素染液（Harris）、伊紅染液（醇溶性）、0.8%鹽酸酒精、梯度乙醇（濃度為85%、90%、95%、無水乙醇）、二甲苯、中性樹膠、載玻片與蓋玻片（世泰）、常規金屬玻片架、新鮮標本、紗布等。

1.3 高清晰度術中冰凍染色流程及技術細節

1.3.1 冰凍切片機操作溫度 ?LEICA冰凍切片機機箱溫度設為-25℃，恒溫待機，標本固定頭工作溫度設為-25℃，機箱及標本固定頭溫度必要時可根據組織類型進行調節。脂肪組織需將標本固定頭溫度調整至-40℃～-50℃，腎組織需將溫度調整至-30℃～-40℃才能達到良好的切片效果[13]。

1.3.2 包埋技術細節 ?取好的標本塊，平放于標本托上，用冰凍標本包埋劑（普通膠水）滴加包裹[14]。小標本（直徑0.1～0.3 mm）應先在標本托上用標本包埋劑打底，凍硬后再將小標本放上去進行二次包埋。標本包埋要平整，尤其是多粒小標本。

1.3.3 冰凍切片技術細節 ?標本托放于速凍臺上，啟動速凍臺，當包埋劑底部由透明開始結凍變白時，將標本托移于冰錘盤并蓋上冰錘。標本凍硬后移于標本固定頭上并切片。常規設置切片厚度為3 μm，必要時可根據組織類型進行厚度調節。疏松結締組織3～5 μm，脂肪組織5～8 μm。先將標本粗修至最大切面，再細修數次至平滑為止，減少粗修對切面造成的小裂隙。勻速轉動手輪進行切片，用帶靜電毛筆吸拉切片，用載玻片平整吸貼切片。每例標本各切片100張。

1.3.4 染色流程技術細節（試劑均為新配） ?（1）將裱好的切片整齊擺放于玻片架上，切片數量一批次可1張至50張不等。（2）將切片放入95%乙醇中30 s。可根據組織類型及切片數量調整浸泡時間，以達到最佳固定效果及脫水效果為準。（3）將切片放入玻璃缸中，流水沖洗10 s，稀釋乙醇，減少對蘇木素染色的影響。（4）甩掉切片及切片架水分，放入塑料染色杯，杯內盛放新鮮蘇木素500 mL，敞口放入微波爐中加熱2 min。微光波的作用不僅能對染液加溫，還能由內至外固定細胞和組織，使切片的組織結構及細胞特征更清晰地展示[7]。（5）將切片放入玻璃缸中，流水沖洗20 s。（6）將切片放入0.5%鹽酸酒精中2 s。可根據組織類型及切片數量調整分化時間，以達到最佳分化效果為準。（7）將切片放入玻璃缸中，流水沖洗20 s。（8）將切片放入熱水中返藍30 s。可根據組織類型及切片數量調整分化時間，以達到最佳藍化效果為準。（9）將切片放入伊紅染液中2 s后提出。由于伊紅染色較快，可將切片適度平放，視覺監控伊紅染色進度，達到標準時，切片呈藍紫色。（10）放入玻璃缸中，流水沖洗10 s。（11）甩掉切片及切片架水分，梯度乙醇脫水（共2 min），二甲苯透明（共2 min）。（12）中性樹膠封片，滴加時精控滴量，避免因覆蓋不全及溢出影響美觀和使用。最后貼上標簽。

1.4 評片標準[15]

冰凍染色制片質量按4類片評定。A類片：組織結構清晰，細胞特征清晰。B類片：組織結構清晰，細胞特征不清晰。C類片：組織結構不清晰，細胞特征清晰。D類片：組織結構不清晰，細胞特征不清晰。術中病理診斷按常規4類報告評定。

1.5統計學處理

采用SPSS17.0軟件進行分析。計量資料用（x±s）表示，采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗，P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 高清晰度術中冰凍制片實際效果展示（微光波干預——以乳腺導管癌為例）

微波爐加熱組A類冰凍切片顯示清晰度高。組織結構層次及細胞特征明顯，色彩鮮艷，圖像線條勾畫銳利。不同的組織類型及腫瘤細胞對比度顯著，容易辨識清楚。單個細胞顯示尤佳，立體感強。細胞結構表達精細，細胞膜、細胞漿、細胞核以及細胞核的微細結構如核膜、核仁、染色質顆粒、染色體、核分裂及對稱性等進步能良好地表達。實驗展示的組織結構層次及細胞特征與標準石蠟HE制片效果基本一致。見封三圖1～4。

2.2 5種術中冰凍染色流程制片效果比較

微波爐加熱組A類片占總構成比的56.6%，恒溫箱加熱組A類片占14.7%，酒精燈加熱組A類片占13.2%，全自動染色機組A類片占8.5%，電吹風加熱組A類片占7%。微波爐加熱組A類片顯著高于其他組。見封三圖5、6。

2.3基于A類片，各實驗組間的兩兩比較

A類片組織結構清晰，細胞特征清晰，接近標準石蠟制片效果，具有檢驗意義，計數資料采用χ2檢驗。本次試驗，微波爐加熱組與酒精燈加熱組、恒溫箱加熱組、全自動染色機組、電吹風加熱組比較，差異具有統計學意義（均P<0.005）。酒精燈加熱組與恒溫箱加熱組、全自動染色機組、電吹風加熱組比較，差異不具有統計學意義（均P>0.05）。全自動染色機組與恒溫箱加熱組、電吹風加熱組比較，差異不具有統計學意義（均P>0.05）。另恒溫箱加熱組與電吹風加熱組比較，差異具有統計學意義（P<0.05）。見表1。

3 討論

3.1 術中冰凍文獻與術中冰凍技術文獻發表數2009～2018年度分布（基于CNKI）

2009～2018年術中冰凍切片技術相關文獻的發表數在整體上呈增加趨勢，從2014年開始有一個顯著的上升，至2016年出現第一個小高峰。2009～2018年術中冰凍文獻的總發表數在整體上略呈下降趨勢，2018年術中冰凍相關文獻發表數為10年歷史最低。見封三圖7。

3.2高清晰度術中冰凍染色流程深析

從2009～2018年術中冰凍相關文獻顯示，術中冰凍制片質量確實在逐年提高，但清晰度與標準石蠟切片比對仍有較大差距[16]。到目前為止，還未見比較成熟系統、革命性改變的冰凍切片制作技術報道。而科技與學術的快速發展已促使社會進步到了一個新的時代，高清晰度術中冰凍染色流程能滿足手術醫師、手術患者、病理醫師的迫切需求[17]。快速病理診斷是手術醫師在手術中決定手術方案的金標準，術中冰凍病理診斷也是病理科采用最多的檢驗方案，其特點就是“短、準、快”。臨床醫師最關注的就是診斷準確，也是其價值意義所在。診斷準確不但要求病理醫師具備系統扎實的醫學功底和豐富有效的臨床經驗，而且術中冰凍切片的清晰度也決定了冰凍病理診斷的準確性和可靠性。

高清晰度術中冰凍切片的制作：首先，要避免組織溶解、組織污染、組織破壞等干擾因素。標本應去除多余脂肪、毛發、線頭、鈣粒或骨碎片及其他硬物。取材時用紗布吸取標本表面水分，作簡單的物理脫水。取材刀鋒利無損能減少組織損傷，提高取材質量。其次，為減少冰晶形成，應避免取材過厚過大及冰凍過慢過長。如腎臟組織質地嫩脆，冰凍過慢時間太長，切片易碎且組織細胞形態變形嚴重。究其原因是水結晶時分為兩種結晶態，即玻璃態與晶體態。將切片機機箱溫度設為-25℃的意義在于迅速將標本冰凍，速凍臺與冰凍錘的配合進一步加快冰凍速度，使接觸面標本盡量呈玻璃態結晶，減少冰晶對組織結構的影響[9]。然后冰凍切片用95%乙醇作適度脫水及從外到內的滲透性固定。蘇木素環節用微光波干預，在加溫染液的同時作由內至外的細胞組織固定。因此冰凍切片實際上是經過簡單有效的組織固定及脫水處理的，故制片效果與標準石蠟切片基本一致。最后染色是制作和診斷的關鍵，其影響因素較多，如染液的使用次數、染液溫度、染色時間、切片厚度面積等。陳錦等[15]研究顯示染液溫度頗為關鍵，過高及過低均不好，以35℃為宜。因此，微光波對染液的加溫時間決定了染液溫度，過長和過短均不好，以2 min為宜。

與其他試驗組比較，本次試驗微波爐加熱組A類片顯著高于其他組，經χ2檢驗，P<0.005，差異具有統計學意義。微波爐加熱組B類片集中于致密的纖維肌肉組織，微波爐加熱組C類片集中于含水量大的疏松組織如腦組織、腎組織等，因受冰晶影響嚴重，組織結構顯示較差。微波爐加熱組D類片出現于玻片挨擠處，影響了試劑作用效果。酒精燈加熱組、全自動染色機組、電吹風加熱組的B類片較多，制片效果傾向于組織結構清晰，細胞特征模糊。恒溫箱加熱組C類片較多，制片效果傾向于細胞特征清晰，組織結構模糊。電吹風加熱組D類片較多，是由于加熱時影響因素過多，如受熱距離、風速、吹風角度等，增加了操作難度，導致制片質量不穩定。酒精燈加熱組、全自動染色機組與恒溫箱加熱組在整體制片質量上沒有顯著差異。筆者圍繞該發現，對不同術中冰凍染色流程的操作步驟及技術細節做了全面系統的探索和試驗，并作了大量文獻復習，然后以微光波技術為基礎，完善了高清晰度術中冰凍染色流程的技術模式。

高清晰度術中冰凍染色流程受到常規石蠟制片流程的啟發，以術中冰凍制片的實驗條件，模擬了標準石蠟制片流程的核心概念，簡化了相關操作步驟，并取得了良好效果，制片質量大幅度提高。其中技術難題之一為術中冰凍切片的有效組織固定，因微光波技術的使用和恰當濃度乙醇的應用得到初步解決。近期文獻劉憲軍[18]的超聲波技術在術中冰凍病理切片制作中的應用對相關組織固定機制做了闡述。微光波技術與超聲波技術的組織固定原理接近，即加速水分子及組織分子的規律運動產生熱效應及良好的固定效果，但微光波技術的固定效果更好一些。另一個技術難題是精細化的組織脫水程度控制，由恰當濃度乙醇的應用及梯度酒精技術的使用得到初步解決，實際脫水效果接近石蠟制片效果。通過不斷地改進和提高對術中冰凍制片技術的理論認知成熟度及實際制片效果，高清晰度術中冰凍染色流程趨于規范嚴謹，技術理論系統完整，制片質量穩定可靠，經得起重復試驗驗證，其發現的意義在于雖然目前的技術流程還不夠精細，但使臨床病理工作者看到了高清晰度術中冰凍病理制片的曙光，可能由此打開一個術中冰凍病理診斷的新時代。在更優越的實驗條件下，高清晰度術中冰凍染色流程應該會有一個更大的持續的發展。

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（收稿日期：2019-06-27）