腐乳生產過程中細菌污染的狀況與分析

廖新浴，陳信賢，劉東紅，葉興乾，尹源明，周建偉,3，謝小本，丁 甜

(1. 浙江大學 生物系統工程與食品科學學院，浙江 杭州 310058; 2. 浙江大學 馥莉食品研究院，浙江 杭州 310058; 3. 浙江大學 寧波理工學院，浙江 寧波 315100；4. 紹興咸亨食品股份有限公司，浙江 紹興 312000)

腐乳是一種傳統的中國豆類發酵食品，是由微生物發酵生產的、類似奶酪的產品，具有獨特的風味，容易被消化，并且具有較高的蛋白質含量[1]。腐乳的生產流程一般包括豆腐切塊、酸泔水點漿、接種、發酵、腌制和加湯料幾大步驟。盡管在發酵培養中使用純培養物，但豆腐生產過程在非無菌開放條件下進行，導致在生產過程中細菌污染的可能性很高。另外，大部分腐乳中雖然含有NaCl (5%～15%)和乙醇(1%～7%)，可以防止病原體存活或生長[1]，但是對于可形成芽孢的芽孢桿菌屬(Bacillusspp.)和梭菌屬(Clostridiumspp.)來說，由于芽孢對環境壓力的耐受能力比較強，比如對鹽有耐受性[2]，仍無法完全抑制它們的存活，從而對腐乳產品的安全性造成了潛在風險[3]。

本文中，筆者將以紅腐乳的生產過程為例，對各個生產環節的細菌進行分離和鑒定，并分析腐乳生產過程中可能存在的食源性致病菌和腐敗菌，以期對腐乳生產工藝優化和安全性問題提供理論依據和研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

細菌DNA提取試劑盒，Personalbio公司；NaCl和甘油，國藥集團化學試劑有限公司。

2720 PCR擴增系統，Applied Biosystems公司；3730XL型DNA測序分析儀，ABI PRISM公司。

1.2 樣品采集

該實驗的腐乳半成品來自于紹興的一家豆腐乳工廠，從8個生產步驟中采集樣品。這8個生產步驟包括：①豆腐原料；②酸泔水點漿過程;③培養發酵噴菌后;④白坯生長中期(7 d后);⑤白坯生長后期(14 d后);⑥腌制1 d后；⑦腌制4 d后；⑧添加紅曲后與其他料之后。

1.3 菌種分離與鑒定

將腐乳樣品使用研缽和研杵勻化，取5 g試樣腐乳和45 mL無菌生理鹽水勻漿。然后將樣品用無菌生理鹽水連續適當稀釋并涂布到平板上培養2 d，挑取形態特征不同的單個菌落到液體培養基中培養24 h，并在平板上劃線，將單個菌落接入液體培養基中，最后分離純化菌種與甘油混合，凍存于-80 ℃。用細菌DNA提取試劑盒提取菌體DNA。對純分離菌株進行16S rDNA基因序列分析。通用引物為27F (5′-A￣G￣A￣G￣T￣T￣T￣G￣A￣T￣C￣C￣T￣G￣G￣C￣T￣C￣A￣G-3′)和1492R(5′-G￣G￣T￣T￣A￣C￣C￣T￣T￣G￣T￣T￣A￣C￣G￣A￣C￣T￣T-3′)。PCR反應是在2720 PCR擴增系統下運行并利用下列條件進行反應：98 ℃ 5 min預變性，其次26個周期的擴增過程包括98 ℃(20 s)、98 ℃(20 s)和72 ℃(7 min)，最后在72 ℃保持10 min。使用ABI PRISM 3730XL DNA測序分析儀進行延伸的最后一步。對PCR產物進行測序(Personalbio公司，上海)，所獲得的序列與GenBank 數據庫(美國國家生物技術信息中心)進行BLAST算法比對。

2 結果與討論

2.1 紅腐乳生產環節中細菌鑒定結果

紅腐乳生產環節中細菌鑒定結果如表1所示。由表1可知：豆腐原料中存在的細菌主要是蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)和惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)。豆腐是腐乳的生產原料，其蛋白質含量為6.0%～8.4%，含水量79%～87%[4]，pH為5.2～6.2[5]。由于其蛋白質、水含量高，具有偏中性pH，因此豆腐很容易被微生物污染[6]。在酸泔水點漿過程中，主要細菌菌株是金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌，這一結果與周婷婷等[7]的研究結果一致，該研究也發現蠟樣芽孢桿菌存在于凝乳豆腐的酸漿水中。接種過程中存在的主要細菌種類是枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌。該步驟中的枯草芽孢桿菌(B.subtilis) 可能來自于接種劑，作為食品中的安全啟動劑存在于隨后的發酵過程中[8]。

發酵中期 (約7 d)主要存在蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumanii)和吉氏庫特菌(Kurthiagibsonii)；在發酵后期 (約14 d)主要存在乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、鮑曼不動桿菌和陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)；腌制1 d后分離鑒定出的菌種包括陰溝腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌2種菌；而腌制4 d后，腐乳只存在陰溝腸桿菌一種菌種，這一結果與姚翔等[9]研究結果一致，隨著腌制時間的延長，腐乳中食鹽的作用會對芽孢桿菌有一定的抑制作用。而添加紅曲后的腐乳中，菌種主要包括鮑曼不動桿菌、蠟樣芽孢桿菌和吉氏庫特菌3種。

表1 紅腐乳生產環節中細菌鑒定結果

2.2 腐乳生產過程中所分離細菌的特性分析

2.1節中研究發現腐乳生產過程中存在的食源性致病菌為蠟樣芽孢桿菌、鮑曼不動桿菌、糞腸球菌、惡臭假單胞菌、金黃色葡萄球菌和陰溝腸桿菌以及腐敗菌如吉氏庫特菌和乳酸乳球菌，對這些細菌的特性進行分析，結果如表2所示。由表2可知，腐乳生產安全性應該給予重視。蠟樣芽孢桿菌是同時具有致病性和致腐性的微生物[10]，當蠟樣芽孢桿菌在腐乳中達到106cfu/g時[7]，有可能會引起惡心、嘔吐和腹瀉的癥狀[11]。蠟樣芽孢桿菌也能產生芽孢，具有耐熱性、耐受冷凍和干燥的特點[11-12]，還能附著于食物接觸表面(例如不銹鋼工具和生產設備)并形成生物膜，并且在表面上積累[13]。糞腸球菌屬于乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB )，但是它也是一種具有致病性和引起食品腐敗的微生物[14]，能夠引起心內膜炎、菌血癥、泌尿、新生兒院內感染、中樞神經系統(CNS)、腹腔和盆腔感染等。像其他腸球菌一樣，它也可以通過基因水平轉移來傳播抗生素抗性基因，從而增加全球耐藥性問題[15]。惡臭假單胞菌被認為是自然環境和人體表面的廣泛細菌污染物[16]。已知惡臭假單胞菌引起食物變質，并且某些種屬可以分泌與發病相關的蛋白質，從而可引起尿路感染、敗血癥和胃腸道感染等疾病[17]。金黃色葡萄球菌是導致嚴重全球性后天感染的重要的人類病原體之一[18]，能產生葡萄球菌腸毒(SE)，從而引起葡萄球菌食物中毒(SFP)[19]。鮑曼不動桿菌具有致病性，可引起一系列嚴重感染病，如血流感染(BSI)等[20-21]，這與其具有的多藥耐藥性(MDR)有關，但是它很少會引起腹瀉的癥狀[22]。吉氏庫特菌可造成食物腐敗，廣泛分布于環境和農場的動物、糞便、土壤、地表水、肉類和冷藏后的肉和肉制品中[23]。 乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)可以產生酸性物質，如乳酸鏈球菌肽 (Nisin)、Pediocin和其他細菌素[24]，這些細胞素主要抑制革蘭氏陽性菌，而對大多數的革蘭氏陰性菌沒有抑制效果[25]，這可能是發酵前期的革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌失去生長優勢的原因[19]。而除了細菌營養體之外，一些細菌如蠟樣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌還能產生芽孢。由于芽孢的生存能力很強，不易消滅，而且孢子黏附能力使其能夠在設備或生產線機器中殘存，從而導致芽孢更難以被清除，都對食品安全性造成了潛在的威脅[26]。

表2 腐乳生產過程中所分離細菌的特性

3 結論

本文中，筆者研究發現腐乳生產過程中存在一些致病菌或者是腐敗菌。腐乳生產過程中分離檢測出的糞腸球菌、惡臭假單胞菌、吉氏庫特菌、金黃色葡萄球菌和陰溝腸桿菌都屬于食源性致病菌，因此需要引起對腐乳生產安全性的注意。有必要在前期生產過程中將污染細菌降低到最低范圍，以保證后期發酵時的微生物安全。保證安全新鮮的豆腐原料是制作豆腐乳的關鍵控制點。應加強維持干凈的生產環境、個人、貯藏等過程中的衛生管理。加強菌種管理，傳統發酵不能夠完全控制微生物活性，所以對菌種進行分離和純化及妥善保藏都是有必要的。