5種含藥材原粉的口服中藥制劑微生物限度檢查方法

王 玉，陳 彤

(徐州市中醫院 制劑室，江蘇 徐州 221009)

微生物檢驗和控制是保障中藥制劑安全性的一項重要措施[1]。徐州市中醫院擁有臨床效果顯著的自制中藥制劑幾十種，皆是由幾種至幾十種藥材組成的復方制劑，有的清涼藥材如蒲公英，其性苦寒，既能清解火熱毒邪，又能泄降滯氣，為清熱解毒、消癰散結之佳品[2]。現代藥理學研究表明：蒲公英不同提取物對沙門菌、金黃色葡萄球菌等5種菌具有明顯的抑制作用[3]。所以，在微生物限度檢查試驗中，要考慮到中藥材本身可能具有的抑菌作用，其會干擾真實的微生物污染的情況。2015 年版《中國藥典》“微生物限度檢查法”在檢驗內容、檢驗方法和培養體系上都有很大改變。因此，對本院的中藥制劑需要按照2015藥典四部通則微生物限度檢查法進行重新驗證。

2015年版藥典對含藥材原粉的口服固體制劑除了對需氧菌、霉菌和酵母菌提出標準要求外，還對控制菌提出以下要求：“每1 g固體制劑不得檢出大腸埃希菌；每10 g固體制劑不得檢出沙門菌；每1 g固體制劑耐膽鹽革蘭陰性菌應小于102cfu[4]”。本研究采用常規法、培養基稀釋法和薄膜過濾法對5 種含藥材原粉的中藥制劑進行需氧菌、霉菌及酵母菌計數方法驗證，用常規法進行各制劑的控制菌檢查方法驗證，從而保證用藥的安全性，以期為廣大科研機構及醫院藥檢室等部門的中藥制劑微生物檢查提供有效的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

FA1204B型分析天平，上海佑科儀器儀表有限公司；SPX-150BSH-Ⅱ型生化培養箱、DHG-9143BS-Ⅲ型電熱恒溫鼓風干燥箱、SYC-B型電熱恒溫調速振蕩器，上海新苗醫療器械制造有限公司；YX-2800 型不銹鋼手提式壓力蒸汽滅菌器，合肥華泰醫療設備有限公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺，蘇州蘇潔凈化設備有限公司。

1.1.2 供試中藥制劑

健男春膠囊(批號：170609、170701和170724)，消痛散結片(批號：170511、170601和170623)，暖宮逐瘀丸(批號：170520、170613和170629)，清咽開音袋泡茶Ⅰ(批號：170505、170529和170611)，消食止瀉散(批號：170428、170524和170613)，5種中藥制劑均由徐州市中醫院制劑室生產和提供。

1.1.3 測試溶液

1)培養基 胰酪大豆胨瓊脂培養基(TSA，批號：1704132)，胰酪大豆胨液體培養基(TSB，批號：20161216)，沙氏葡萄糖瓊脂培養基(SDA，批號：170620)沙氏葡萄糖液體培養基(SDB，批號：20161125)，麥康凱液體培養基(批號：170315)，麥康凱瓊脂培養基(批號：1703292)腸道菌增菌液體培養基(EE，批號：1511262)，木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基(XLD，批號：151214)，RV 沙門菌增菌液體培養基(批號：1511303)，紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基(批號：1511242)，以上10種培養基均購于北京三藥科技開發公司。

2)稀釋液 pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(批號：160505)，購于北京三藥科技開發公司。

3)菌株 金黃色葡萄球菌[菌株型號CMCC(B)26003]、銅綠假單胞菌[菌株型號CMCC(B)10104]、枯草芽孢桿菌[菌株型號CMCC(B)63501]、白色念珠菌[菌株型號CMCC(F)98001]、黑曲霉[菌株型號CMCC(F)98003]、乙型副傷寒沙門菌[菌株型號CMCC(B)50094]、大腸埃希菌[菌株型號CMCC(B)44102]，以上菌株均為第4代，購于南京茂捷生物科技有限公司。

1.1.4 試驗菌液的制備和使用

試驗菌液的制備和使用方法詳見參考文獻[4]。

1.2 常規法測定需氧菌、霉菌及酵母菌回收率

1.2.1 實驗原理

采用2015版藥典通則1105平皿法進行檢測。

1.2.2 菌液的配制

將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌和白色念珠菌的新鮮培養物用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋制成500～1 000 cfu/mL的菌懸液備用。取黑曲霉的新鮮培養物，加入5 mL含0.05%(mL/mL)聚山梨酯80的稀釋液，將孢子洗脫，將其懸液轉移至無菌試管中，制成500～1 000 cfu/mL 的菌懸液菌液備用[4-5]。

1.2.3 供試液的配制

精確量取各供試中藥制劑10 g，分別加入稀釋液100 mL(1∶ 10)，45 ℃振蕩，分散均勻，制成供試液備用。

1.2.4 各實驗組的配制

試驗組：取1 mL供試液和0.1 mL試驗菌懸液，混勻后，分別加至無菌平皿中，加入適量的TSA或者SDA，每組平行制備2個平皿，按平皿法測定菌落數。試驗重復3次。其中TSA用來需氧菌的計數；SDA用來霉菌和酵母菌的計數。

供試品對照組：取1 mL供試液，按平皿法測定供試品本底菌數。

菌液對照組：取0.1 mL試驗菌懸液與1 mL稀釋液混勻，加至無菌平皿中，按照試驗組方法進行測定。

陰性對照組：取稀釋液1 mL 分別注入無菌平皿中，作陰性對照組。

1.2.5 結果判斷

試驗組菌落數減去供試品對照組菌落數與菌液對照組菌落數的比值應在0.5～2.0。

1.3 培養基稀釋法測定需氧菌、霉菌及酵母菌回收率

1.3.1 實驗原理

培養基稀釋法是將供試液中加入較大量的培養基，使該供試液稀釋至不具抑菌作用的濃度。

1.3.2 各實驗組的配制

試驗組：取0.1 mL試驗菌懸液至10 mL供試液中，其他操作與常規法相同。

供試品對照組：取0.2 mL供試液，只加入稀釋液，按試驗組操作。

菌液組：取0.2 mL試驗菌懸液加至無菌平皿中，倒入適量培養基，測定菌落數。

陰性對照組：將0.2 mL稀釋液加至無菌平皿中，倒入適量培養基，作為陰性對照組。

1.3.3 結果判斷

實驗結果的判斷同1.2.5節中的方法。

1.4 薄膜過濾法測定需氧菌、霉菌及酵母菌回收率

1.4.1 實驗原理

微孔濾膜可以對細菌進行有效的攔截，薄膜過濾法在藥品的微生物限度檢驗時可順利去除藥物中所含抑菌成分[6]。

1.4.2 各實驗組的配制

試驗組：取供試液1 mL 與適量的稀釋液混勻，用孔徑為0.45 μm的濾膜過濾，濾膜用適量緩沖液沖洗3次，第3次沖洗時加入0.1 mL試驗菌液，沖洗完成之后，將濾膜菌面向上，貼附瓊脂培養基表面，培養結束，測定菌落數。

供試品對照組：按試驗組操作，最后一次沖洗不加試驗菌。

菌液組：用稀釋液替代供試液，其他同試驗組操作。

陰性對照組：稀釋液代替供試品，不加陽性菌液，其他操作同試驗組。

1.4.3 結果判斷

實驗結果的判斷同1.2.5節中的方法。

1.5 控制菌檢查方法的驗證

1.5.1 各實驗組配制

1)大腸埃希菌：取0.1 mL大腸埃希菌液與10 ml按1.2.2節各供試液混勻，移至100 mL TSB中，32 ℃培養1 d，量取1 mL與100 mL麥康凱液體培養基混勻，42 ℃培養2 d。然后采用劃線接種法接種至麥康凱瓊脂培養基平板上，32 ℃培養2 d。

2)沙門菌：取各供試中藥制劑10 g至200 mL TSB中，分散均勻成供試液。取0.1 mL沙門菌液與上述供試液混勻，置32 ℃培養1 d，量取0.2 mL與20 mL RV 沙門菌增菌液體培養基混勻，32 ℃培養2 d后，劃線接種至XLD平板上，32 ℃培養2 d。

3)銅綠假單胞菌：取各供試中藥制劑10 g至100 mL TSB中，分散均勻成供試液。取0.1 mL的銅綠假單胞菌懸液與上述供試液混勻后，加至10 mL EE中，32 ℃培養2 d，采用劃線接種法接種至紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基上，32 ℃培養2 d。

陽性對照組：稀釋液代替供試液，按上述操作。

陰性對照組：稀釋液代替供試液，不加菌液，按上述操作。

1.5.2 結果判斷

若培養基平板上有菌落生長，應進行分離、純化及適宜的鑒定試驗，確證是否為控制菌；若沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結果為陰性，判定供試品未檢出控制菌。

2 結果和討論

2.1 常規法驗證5種含藥材原粉的中藥制劑對各試驗菌株的回收比值

根據常規法檢測的試驗結果，計算各試驗菌株的比值，結果見表1。由表1可知：健男春膠囊、暖宮逐瘀丸和消食止瀉散對各試驗菌的回收比值均為0.5～2.0，符合《中國藥典》2015版四部通則的回收率規定，可用常規法進行微生物限度檢查。而消痛散結片與清咽開音袋泡茶Ⅰ的回收比值小于0.5，說明這2種中藥制劑皆具有一定的抑菌性，須重新驗證。

2.2 培養基稀釋法驗證消痛散結片與清咽開音袋泡茶Ⅰ對各試驗菌株的回收比值

消痛散結片能行氣活血，軟堅散結，臨床用于肝郁痰凝、瘀血腫塊、乳癖、癭瘤和脂瘤等癥。其方中含有三棱、青皮、柴胡、海藻和煅牡蠣等，有文獻研究指出：柴胡水提物對金黃色葡萄球菌有顯著的抑制作用[7]，海藻所含有的間苯三酚具有抗金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌活性[8]。根據本研究中培養基稀釋法檢測的試驗結果，計算各試驗菌株的比值，結果見表2。由表2可知：消痛散結片對各試驗菌的回收比值均為0.5～2.0，符合標準規定。結果表明采用培養基稀釋法，可消除消痛散結片的抑菌性，可用來對消痛散結片的微生物檢查驗證。而清咽開音袋泡茶Ⅰ的需氧菌回收比值小于0.5，不符合相關規定，所以清咽開音袋泡茶Ⅰ仍需采用薄膜過濾法進行驗證。

表1 常規法檢查需氧菌、霉菌及酵母菌的回收比值

表2 培養基稀釋法檢查需氧菌、霉菌及酵母菌回收比值

2.3 薄膜過濾法驗證清咽開音袋泡茶Ⅰ對各試驗菌株的回收比值

清咽開音袋泡茶Ⅰ由薄荷、金銀花、胖大海、浙貝母和黃芩等十味藥組成，具有清熱消腫，利咽開音功效，可用于急、慢性咽喉炎。其中薄荷提取物，尤其是薄荷精油枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌有抑制效果[9]、金銀花提取物對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌具有較強的抑菌作用[10-11]、黃芩也被多次報道對各種細菌具有很強的抑制作用[12]。根據薄膜過濾法試驗結果，計算出各試驗菌株的回收比值，需氧菌、霉菌和酵母菌回收比值見表3。由表3可知：清咽開音袋泡茶Ⅰ采用薄膜過濾法5 種菌種的回收比值均在0.5～2.0，其本身的抑菌作用可以通過薄膜過濾法消除。

2.4 控制菌檢查方法驗證

對文中所選的5種含藥材原粉的中藥制劑的控制菌檢查結果見表4。由表4可知：試驗組和陽性對照組能正常檢出控制菌，陰性對照未檢出，5種供試品對控制菌無明顯抑制作用，所以該方法可用來對這5種口服中藥制劑進行控制菌檢查。

表3 薄膜過濾法檢查需氧菌、霉菌及酵母菌回收比值

表4 控制菌檢查方法驗證

注：+表示有抑菌作用；-表示無抑菌作用。

3 結論

我院中藥制劑多為含有多種中藥組成成分的復方制劑，必須經過驗證，采取合適的試驗方法去除制劑本身的抑菌作用，才能真實反映制劑的微生物污染情況。根據本研究試驗結果表明：

1)健男春膠囊、暖宮逐瘀丸和消食止瀉散屬于無明顯抑菌作用的制劑，可以采用常規法檢查微生物限度。消痛散結片本身具有明顯的抑菌作用，本研究結果還表明：消痛散結片的抑菌作用可以通過培養基稀釋法消除，培養基稀釋法適合作為其微生物限度檢查手段。而清咽開音袋泡茶 Ⅰ 由于組方成分及特性，具有很強的抑菌作用，采用培養基過濾法時并不能消除這一作用，而選用薄膜過濾法能有效消除清咽開音袋泡茶Ⅰ抑菌作用，各陽性菌回收比值均為0.5～2.0，符合2015版藥典的規定。因此薄膜過濾法適合作為清咽開音袋泡茶Ⅰ的微生物限度檢查方法。根據本文的控制菌檢查結果顯示5種中藥制劑對控制菌無明顯抑制作用，所以常規法可用來對這5種口服中藥制劑進行控制菌檢查。

2)通過微生物計數回收驗證試驗，能有效地消除中藥制劑的抑菌作用，保證試驗結果的準確性及科學性。作為制劑質量控制人員應重視微生物計數方法的適用性，提高專業素質，加強質量控制，認真做好制劑衛生檢查工作，以確保人民群眾用藥的安全性、有效性。