一株嗜酸乳桿菌的分離與鑒定

吳家鑫，王 崢，史旭軍，劉沛溢，蘇 寧，閆 妍，王 瑞

(1.北京化工大學 生命科學與技術學院 北京市生物加工過程重點實驗室，北京 100029；2.桂林長發小寨生物科技有限公司，廣西 桂林 541000；3.北京佰草國頤堂醫學研究院，北京 100012；4.中國檢驗檢疫科學研究院 化妝品技術中心，北京 100176)

微生態學(Microexology)由德國Rush博士于1977年首次明確提出，在微生物學基礎上吸收了生物學思想而發展起來，主要研究正常微生物群與其宿主相互依賴、相互制約的邊緣學科，是細胞水平或分子水平的生態學[1]。人體體表和體腔存在大量的微生物種群，它們分別定植于胃腸道、口腔、皮膚、呼吸道、泌尿道等，與其生存的微環境共同構成人體微生態系統[2]。

目前的微生態研究主要集中于胃腸道系統，隨著近年來的逐步深入，人們逐漸意識到皮膚微生態的變化可能會導致皮膚出現問題甚至疾病[3]。皮膚表面具有多種菌群，通常可以分為常駐菌和暫住菌[4]。暫住菌通過接觸外界環境獲得，常常會引起皮膚感染；常駐菌是在健康皮膚表面定居的微生物，具有多種調節功能[4-5]。常駐菌可以通過調控皮膚角質形成細胞表達抗菌肽來抵御外界病原菌在皮膚表面的生長[5]，可以直接分泌抗菌肽抑制病原菌定植[6]，可以分解角質細胞的碎屑或脂質，維持表皮的酸性環境，有效地抵御外界病原菌的入侵[7]，可以間接調節機體免疫反應[8]。

桂林市黃洛瑤寨地區人群在洗發過程中長期使用淘米水發酵液，對發質和頭發根部頭皮具有良好的養護作用，為了深入研究發酵淘米水中菌株對頭發和頭皮微生態的影響，對淘米水發酵液進行菌株的分離與鑒定，得到3株嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)疑似菌株，通過菌株的菌落形態、顯微形態、生理生化試驗、分子生物學試驗進行鑒定。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

淘米水發酵液，來源于廣西壯族自治區桂林市龍勝縣龍脊鎮金江村黃洛瑤寨(長發村)。

LBS瓊脂培養基[9]，MRS培養基[9]，營養瓊脂(NA)培養基[9]，沙氏瓊脂(SDA)培養基[10]，MC培養基[11]。

DNA快速提取試劑(PrepMan Ultra)、瓊脂糖、PCR試劑(Taq酶，10×Taq Buffer(Mg2+)，dNTP Mixture，rTaqDNA polymerase，重蒸水等)、ExoSAP-IT PCR產物純化試劑盒、測序試劑(BigDye Terminator，5×Sequencing Buffer)、BigDye XTerminator Purification Kit純化試劑盒、革蘭氏染色液，Invitrogen公司；莫匹羅星鋰、半胱氨酸鹽酸鹽，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 試驗設備

Eppendorf Research plus移液器(1 000 μL、200 μL 、100 μL、10 μL)、Eppendorf MixMate渦旋振蕩器、Centrifuge5810R型離心機，Eppendorf公司； PowerPac Basic電泳儀、VersaDoc MP 4000 型凝膠成像儀，Bio-Rad公司；Veriti 96 Well Thermal Cycler PCR儀，Thermo Fisher公司；AB3500、AB3130型基因分析儀，ABI公司；DM2500型光學顯微鏡，Leica公司；Esco AC2-4S1型二級生物安全柜，Esco公司；DHP-9272B型電熱恒溫培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；AW 300SG型厭氧培養箱，ELECTROTEK公司；HPP260型恒溫恒濕培養箱，MEMMERT公司；BD Phoenix 100型全自動微生物檢定儀，BD公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株的分離純化

將淘米水發酵液進行梯度稀釋，將冷卻至約50 ℃的LBS瓊脂培養基倒入滅菌后的培養皿中，待其凝固，待用。取1.0 mL合適稀釋度的稀釋液置于LBS固體培養基上涂勻，37 ℃厭氧培養36～48 h。

在LBS瓊脂平板上，挑取具有乳酸菌典型特點并且生長旺盛的單菌落，通過革蘭染色后，挑取含有革蘭陽性菌的單菌落在LBS瓊脂平板上再次進行劃線培養，37 ℃厭氧培養36～48 h，重復分離純化培養至少3次。

在MRS瓊脂平板上劃線分離純化革蘭陽性菌單菌落，37 ℃厭氧培養36～48 h，重復操作3～5次，直到獲得單菌株的純培養物。將該菌株進行斜面劃線培養，4 ℃保藏備用。

1.3.2 菌株生理生化鑒定

將樣品原液用生理鹽水10倍系列稀釋成10-7～10-1個/mL樣品稀釋液，各取1 mL樣品稀釋液分別注入到滅菌的90 mm平皿內，分別將NA培養基、SDA培養基、MC培養基、MRS培養基、莫匹羅星鋰鹽和半胱氨酸鹽酸鹽改良MRS培養基(以下簡稱“改良MRS”)傾注到平皿內，每皿15 mL，搖勻，每個稀釋度2個平行。NA培養基置于30 ℃培養箱中培養24～48 h，SDA培養基置于28 ℃培養箱中培養48～72 h，MC培養基置于36 ℃培養箱中培養48～72 h，MRS培養基和改良MRS培養基置于厭氧罐中，36 ℃培養箱中培養48～72 h。

根據各培養基上生長的菌落特征進行革蘭氏染色鏡檢并計數，并根據鏡檢結果將菌落在培養基上進行分離純化至3 代，應用全自動微生物鑒定儀對3 代純菌種進行46種生化試驗，充分對微生物進行菌屬識別(ID)分析。

1.3.3 菌株分子生物學鑒定

提取分離菌株的基因組DNA，該菌株基因組DNA為模板，擴增其16S rDNA基因片段。PCR反應體系為：10×Buffer(Mg2+)2.5 μL，dNTP Mixture(各 2 mmol/L)2 μL，上游引物(25 μmol/L)1 μL，下游引物(25 μmol/L)1 μL，rTaqDNA polymerase(5 U/μL)0.2 μL，

DNA模版 2 μL，補足重蒸水至終體積25 μL。

PCR反應條件：95 ℃ 3 min預變性，94 ℃ 45 s變性，33 ℃ 30 s退火，72 ℃ 1 min延伸，30個循環，72 ℃ 10 min延伸。引物序列上游引物F：5′-T￣T￣G￣A￣T￣C￣T￣G￣G￣A￣T￣T￣A￣C￣C￣G￣C￣G￣G￣C-3′，下游引物R：5′-A￣G￣G￣G￣T￣A￣T￣C￣T￣A￣A￣T￣A￣C￣T￣C￣C￣T￣A￣C-3′。

2 結果與討論

2.1 菌株的分離純化

用LBS 培養基從淘米水發酵液中共分離純化得到5株具有乳酸菌典型特點的菌株，其中3株菌株為革蘭氏陽性菌，可作為嗜酸乳桿菌疑似菌株，編號為1-3，3株乳桿菌疑似菌株菌落形態見表1，菌株放大1000倍后顯微形態見圖1。

表1 菌株菌落形態及革蘭氏染色結果

圖1 菌株顯微形態(1 000倍放大)Fig.1 Microscopic morphology of three bacterial strains(×1 000)

2.2 菌株生理生化鑒定

通過對3株嗜酸乳桿菌疑似菌株進行46項生理生化試驗，結果見表2。

由表2可初步確定3號菌株與嗜酸乳桿菌的生理生化指標相近，其鑒定可信度達到90%。

表2 3號菌株46種生理生化鑒定結果

2.3 菌株分子生物學鑒定

細菌rRNA(核糖體RNA)按沉降系數分為3種，分別為5S rRNA、16S rRNA和23S rRNA。16S rDNA是細菌染色體上編碼16S rRNA相對應的DNA序列。16S rDNA由于大小適中，既能體現不同菌屬之間的差異，又能利用測序技術較容易地得到其序列[12-13]。在 16S rRNA 分子中，可變區序列因細菌不同而異，恒定區序列基本保守，所以可利用恒定區序列設計引物，將16S rDNA片段擴增出來，利用可變區序列的差異來對不同菌屬、菌種的細菌進行分類鑒定[14-15]。

將3號菌株進行16S rDNA測序，其序列如下。

5′-T￣G￣C￣T￣G￣G￣C￣A￣C￣G￣T￣A￣G￣T￣T￣A￣G￣C￣C￣G￣T￣G￣A￣C￣T￣T￣T￣C￣T￣G￣G￣T￣T￣G￣A￣T￣T￣A￣C￣C￣G￣T￣C￣A￣A￣A￣T￣A￣A￣A￣G￣G￣C￣C￣A￣G￣T￣T￣A￣C￣T￣A￣C￣C￣T￣C￣T￣A￣T￣C￣C￣T￣T￣C￣T￣T￣C￣A￣C￣C￣G￣A￣C￣A￣A￣C￣A￣G￣A￣G￣C￣T￣T￣T￣A￣C￣G￣A￣T￣C￣C￣G￣A￣A￣A￣A￣C￣C￣T￣T￣C￣T￣T￣C￣A￣C￣T￣C￣A￣C￣G￣C￣G￣G￣C￣G￣T￣T￣G￣C￣T￣C￣C￣A￣T￣C￣A￣G￣A￣C￣T￣T￣G￣C￣G￣T￣C￣C￣A￣T￣T￣G￣T￣G￣G￣A￣A￣G￣A￣T￣T￣C￣C￣C￣T￣A￣C￣T￣G￣C￣T￣G￣C￣C￣T￣C￣C￣C-3′。

將測序結果用 BLAST進行序列比對，結果表明該菌株與GenBank中發表的嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)同源性為 99%。可見3號菌株與嗜酸乳桿菌同源性較強，鑒定該菌株為嗜酸乳桿菌，命名為CFC-001。

嗜酸乳桿菌具有多種益生功效，包括調節腸道菌群失調，通過殺菌和競爭附著位點的作用抑制病原菌的滋生和入侵，調節免疫力,延緩機體衰老等作用[16]。

目前桂林市黃洛瑤寨地區人群在洗發過程中長期使用淘米水發酵液，不使用任何洗發水和護發素，該地區發質和頭發根部頭皮質量都要優于其他地區。經過本實驗篩選后發現該淘米水發酵液中嗜酸乳桿菌的菌落總數達到3.8×107CFU/mL，是該體系中的優勢菌群之一，所以認為嗜酸乳桿菌可以對頭發和頭皮的微生態產生積極的影響，可以有效養護頭發與頭皮，但是作用機制尚不明確，需進行進一步的研究。

3 結論

從淘米水發酵液中分離得到3株嗜酸乳桿菌疑似菌株，通過菌株菌落形態、顯微形態、革蘭氏染色、46項生理生化指標和分子生物學鑒定方法，綜合確定其中一株菌為嗜酸乳桿菌，并且命名為CFC-001。