生物分離法制備細胞色素C質量的影響因素

劉文靜，鄭永祥，張 革，唐章勇，余 蓉

(1.四川大學 華西藥學院，四川 成都 610041；2.四川德博爾制藥有限公司，四川 德陽 618000)

細胞色素C是由103～113個氨基酸殘基組成、分子量約為12 000～13 000的一種重要的氧化還原血紅蛋白酶，是生命體內氧化還原鏈上重要的電子傳遞體。細胞色素C肽鏈中心包裹著一個鐵卟啉環，通過鐵卟啉環中心Fe價態的轉換來達到糾正呼吸的作用[1]。目前，細胞色素C在臨床上主要用于各種組織缺氧的急救；對抗癌藥物引起的白細胞降低、四肢循環障礙、肝臟疾患和腎炎亦有一定改善作用[2]；同時有研究發現，細胞色素C可誘導細胞凋亡，用于抗癌治療[3-5]。

但細胞色素C存在穩定性不好、誘發臨床過敏等問題[6-7]，限制了其在臨床上的廣泛應用。而過敏反應的發生與純度有關，純度越高，過敏發生率越低[8]。為了減少細胞色素C臨床副反應，提高藥物療效，進一步提高細胞色素C質量，需嚴格控制細胞色素C生產工藝。生化藥品的質量受到生產過程各個環節因素的影響，細胞色素C傳統生產工藝常用三氯乙酸作為沉淀劑，通過可逆沉淀來純化細胞色素C，然而有研究報道三氯乙酸可能會引起細胞色素C發生變性與聚合[9]。因此，目前有研究者對細胞色素C傳統生產工藝進行了改進[10-11]，并對新舊工藝制備的細胞色素C純度進行分析[12]。但對于傳統工藝中三氯乙酸如何影響細胞色素C的質量尚未明確闡明，深入研究三氯乙酸對細胞色素C質量的影響及其作用方式有助于為細胞色素C生產工藝改進提供理論指導。

本文中，筆者采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)、液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)來對比分析三氯乙酸對細胞色素C質量的影響，以期提高細胞色素C質量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試樣品

傳統工藝制備的細胞色素C原料藥溶液(批號：2018001)、新工藝制備的細胞色素C原料藥溶液(批號：2018002、2018003、2018004、2018005、2018006、2018007)，四川德博爾制藥有限公司；新工藝制備的細胞色素C原料藥溶液(批號：2018008)，實驗室自制；細胞色素C對照品(細胞色素C注射液，批號：20170422)，安徽宏業藥業有限公司；細胞色素C標準品(批號：140670-200501)，中國食品藥品檢定研究院。

1.1.2 試劑與儀器

乙腈(色譜級)、甲酸(色譜級)、甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮(TPCK)處理的胰蛋白酶(T1426)、三羥甲基氨基甲烷，Sigma-Aldrich公司；預染蛋白(Marker)，美國Thermo Scientific公司；其余試劑皆為市售國產分析純。

液相色譜-四級桿飛行時間串聯質譜(miroTOF-QⅡ質譜儀，Bruker Daltonics公司；LC-20AD型納升液相儀，Shimadzu公司)；Sorvall ST 16R型冷凍離心機、902-ULTS型酶標儀，Thermo Scientific公司；VE-186型電泳系統，上海Tanon公司；2014AE64型全自動凝膠成像系統，北京五洲東方科技發展有限公司；UPH-I-20T型超純水器，四川優普公司；丁基-瓊脂糖凝膠(Butyl-Sepharose FF)層析柱，常州天地人和公司；HD-21-1 型核酸蛋白檢測儀，HD-A型電腦采集器，上海青浦滬西儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 細胞色素C制備

細胞色素C的傳統工藝參照文獻[13]進行。

細胞色素C新工藝[12]采用疏水層析純化取代了三氯乙酸沉淀，其他步驟都應用傳統工藝[13]。

疏水層析純化：鹽析后細胞色素C 上清液用丁基-瓊脂糖凝膠(Butyl-Sepharose FF)疏水層析柱純化，采用硫酸銨濃度梯度洗脫。A洗脫液為含質量分數為45%硫酸銨的20 mmol/L磷酸鹽(pH 7.0)緩沖液；B洗脫液為20 mmol/L磷酸鹽(pH 7.0)緩沖液。洗脫程序為0～40 min 100%A，40～80 min 25%B，80～120 min 50%B，120～160 min 75%B，160～200 min 100%B。先用100%A洗脫液平衡柱子，將鹽析后含細胞色素C 的上清液緩慢加入層析柱中，按照上述程序進行梯度洗脫，每個梯度用約10倍柱體積(柱體積5 mL)洗脫液洗脫。流速1.2 mL/min，檢測波長280 nm，收集最大吸收峰洗脫液。洗脫液經超濾，透析得到新工藝制備的細胞色素C原料藥溶液樣品(批號：2018008)。

制備的細胞色素C樣品經過2015版《中國藥典》[14]細胞色素C溶液項下的鑒別、含量測定，符合藥典規定。

1.2.2 SDS-PAGE分析細胞色素C

非還原SDS-PAGE法分析細胞色素C純度：配制5%濃縮膠與15%分離膠的不連續緩沖系統。細胞色素C原料藥樣品、對照品、標準品分別加超純水稀釋至1 mg/mL，按體積比4∶ 1分別加入5倍非還原蛋白上樣緩沖液，混勻，在沸水中孵育5 min，離心。細胞色素C樣品上樣量6 μL、標準蛋白上樣量3 μL。電泳操作參見2015版《中國藥典》通則0541第五法[15]。

還原性SDS-PAGE：取含有分子量2.5×104蛋白的細胞色素C標準品、對照品、原料藥樣品(2018001批次)進行還原性SDS-PAGE，以上3批樣品分別加超純水稀釋至1 mg/mL，按體積比4∶ 1分別加入5倍還原性蛋白上樣緩沖液處理，其余實驗操作同上述非還原SDS-PAGE法。

1.2.3 LC-MS/MS分析與鑒定細胞色素C二聚體

色譜條件：Acclaim PepMap 100 C18 (5 μm,5 mm×0.3 mm,10 nm)預柱，Thermo Scientific公司；Venusil?XBP C18(5 μm,4.6 mm×150 mm,15 mm)分析柱，Agela Technologies公司。流動相0.1%甲酸水溶液(A)- 0.1%甲酸乙腈溶液 ( B )，層析程序為0～4 min 5% B，4～30 min 5%～40% B，30～35 min 40%～80% B，35～45 min 80% B，45～45.1 min 80%B～5% B，45.1～62 min 5% B；總流速 400 nL/min；上樣量10 μL。

質譜條件：正離子模式掃描，一級掃描范圍50～2 200m/z，分辨率20 000，碎裂模式誘導碰撞解離(CID)，碰撞氣體Ar，離子源電壓1 500 V，毛細管溫度150 ℃，二級掃描范圍依賴于一級母離子質荷比自動選擇。

切下非還原SDS-PAGE凝膠中細胞色素C(2018001批次)樣品的2.5×104條帶，經消化脫色、還原烷基化、胰蛋白酶酶解處理后，進行LC-MS/MS分析并與豬源蛋白庫搜尋鑒定。用質譜采集軟件Bruker Daltonics micro TOF control提取質譜數據，利用 Data Analysis 軟件標峰后，采用MASCOT search engine version 2.3.01搜索豬源蛋白庫，進行鑒定。

2 結果與討論

2.1 疏水層析圖譜

新工藝制備細胞色素C的疏水層析圖譜見圖1。由圖1可知：鹽析后含細胞色素C的上清液與Butyl-Sepharose FF層析柱在高鹽濃度緩沖液中吸附，低鹽濃度洗脫液中解吸附，在約120 min處出現1個極大吸收峰，該峰為細胞色素C峰，其余小吸收峰多為雜蛋白峰。結果表明采用疏水層析法能有效分離細胞色素C與雜蛋白。

圖1 細胞色素C疏水層析圖譜Fig.1 Hydrophobic chromatography of cytochrome C

2.2 SDS-PAGE分析細胞色素C結果

非還原SDS-PAGE分析細胞色素C的結果見圖2。由圖2可知：所有細胞色素C供試樣品都含有1.22×104的豬心細胞色素C，其中細胞色素C標準品、對照品、2018001批次樣品還包含1個大小約2.5×104的蛋白，余下幾批次樣品不含該蛋白質。通過比較這些樣品的生產工藝發現，細胞色素C標準品、對照品、2018001批次樣品制備過程中均使用了三氯乙酸作為沉淀劑，而其余7個批次樣品制備過程中未使用三氯乙酸。這提示約2.5×104大小的蛋白分子條帶與生產過程中使用三氯乙酸沉淀劑之間具有某種關聯性，而三氯乙酸沉淀劑容易引起細胞色素C聚合，該蛋白分子量約2.5×104，恰為細胞色素C分子量(1.22×104)的2倍，所以可以推斷：2.5×104處的蛋白很可能是2個細胞色素C分子聚合而成的二聚體。

二硫鍵是蛋白質聚合常見的連接方式，為了驗證該蛋白是否為二硫鍵連接的細胞色素C二聚體，因此采用還原性SDS-PAGE進一步分析該蛋白，若經還原劑處理后2.5×104附近的條帶消失，且不出現其他新的條帶，則說明該蛋白是由兩個細胞色素C分子通過二硫鍵連接而成的二聚體。具體分析結果見圖3。由圖3可知：泳道1～3為細胞色素C經還原劑處理后的蛋白樣品，泳道4～6為未經還原劑處理的細胞色素C蛋白樣品，以上所有樣品都顯示存在分子量約2.5×104的條帶，這說明此2.5×104蛋白不是由肽鏈間二硫鍵連接的二聚體，而可能是2個細胞色素C分子以非二硫鍵方式形成的二聚體，為了驗證此猜想需要進一步分析二聚體的結構。其中，經還原劑處理蛋白樣品的該條帶略高于未經還原劑處理的蛋白樣品的對應條帶，筆者認為這可能是因為未還原的蛋白質可能不會被SDS完全飽和[16]，這使得該類蛋白的分子質量測定結果不如完全變性的蛋白的分子質量測定結果明確，從而造成電泳遷移速度的差異。

M—標準蛋白；1—標準品； 2—對照品；3—2018001批次；4—2018002批次；5—2018003批次；6—2018004批次；7— 2018005批次；8—2018006批次；9—2018007批次；10—2018008批次圖2 細胞色素C非還原SDS-PAGE分析Fig.2 Non-reduced SDS-PAGE analysis of cytochrome C

M—標準蛋白；1—標準品+還原劑；2—對照品+還原劑；3—2018001批次+還原劑；4—非還原標準品；5—非還原對照品；6—非還原2018001批次圖3 細胞色素C還原性SDS-PAGE、非還原SDS-PAGE分析Fig.3 Reduced and non-reduced SDS-PAGE analysis of cytochrome C

2.3 LC-MS/MS分析與鑒定細胞色素C二聚體結果

為了驗證分子量約2.5×104的蛋白是否為細胞色素C二聚體，需要進一步分析其氨基酸序列，因此對傳統工藝制備的細胞色素C樣品(2018001批次)非還原SDS-PAGE圖譜中的2.5×104蛋白質進行LC-MS/MS分析，圖4為該蛋白分子的一級質譜圖，肽段信息如表1所示。對多個肽段進行了二級質譜分析，圖5列舉了其中最長的一段18肽(氨基酸序列為GITWGEETLMEYLENPKK，分子量為2 137.0)的一級質譜圖，選擇m/z=1 069.5的雙電荷正離子為母離子，得到該18肽的二級質譜圖，見圖6。將分析得到的2.5×104蛋白的質譜數據采用Mascot與豬源蛋白庫搜尋鑒定，結果見表2。由表2可知：該蛋白與豬源細胞色素C比對有最高得分3 461，有最大的覆蓋率76%，同時結合其他蛋白的分子量分析，可以推測該2.5×104大小的蛋白只含有細胞色素C分子；再結合經還原劑處理的細胞色素C樣品的SDS-PAGE電泳結果可知，此蛋白是由2個細胞色素C以非二硫鍵的其他某種共價鍵連接而成的二聚體。

細胞色素C二聚體的存在會降低細胞色素C原料藥的純度，增大引發過敏的概率，影響產品穩定性。由于細胞色素C二聚體自身不如細胞色素C穩定，且在細胞色素C原料藥中含量極低，又與主成分性質相近，不易檢測，須從源頭上控制，因此應盡量在細胞色素C制備過程中不使用三氯乙酸，以免產生細胞色素C二聚體。

表1 細胞色素C二聚體的LC-MS/MS分析的肽段信息

圖5 荷質比1 069.5的一級質譜圖Fig.5 Mass spectrum of ion with mass to charge ratio of 1 069.5

圖6 荷質比1 069.5的二級質譜圖Fig.6 MS/MS of ion with mass to charge ratio of 1 069.5

序號蛋白序列號蛋白描述分子量得分覆蓋率/%1p62895細胞色素C11 8103 461762A0A286ZW70肽基脯氨酰順反異構酶23 8271 895623A0A287B5W2未標記蛋白26 5631 007234A0A286ZY95纖維連接蛋白1265 75692685A0A287AKA2未標記蛋白34 588903486F1SGG3角蛋白 165 006706117I3LDS3角蛋白1059 230623168F1SLQ7線粒體核糖體循環因子29 099552379P02189肌紅蛋白17 0745255110A0A287AEL2角蛋白1456 30044327

3 結論

主要針對細胞色素C生產工藝的重要因素——三氯乙酸對細胞色素C質量的影響開展研究，采用SDS-PAGE分析不同工藝下的細胞色素C樣品，發現生產工藝中有使用三氯乙酸沉淀劑的細胞色素C標準品、對照品、傳統工藝制備的細胞色素C樣品(2018001批次)在約細胞色素C分子量2倍大小處出現明顯條帶(約2.5×104)，而采用無三氯乙酸沉淀劑的生產工藝制備的細胞色素C樣品(2018002～2018008批次)沒有此條帶。根據三氯乙酸會使細胞色素C變性與聚合的性質，推測該蛋白可能是細胞色素C二聚體。

進一步采用LC-MS/MS分析與搜尋鑒定該蛋白，發現傳統工藝制備的細胞色素C 樣品(2018001批次)中該蛋白與豬源細胞色素C的相似性得分最高(3461)，覆蓋率最大(達到76%)，并結合相關蛋白質的分子量分析，可以證明該蛋白為細胞色素C二聚體。

本研究首次探明了細胞色素C制備過程中三氯乙酸沉淀劑易導致細胞色素C形成二聚體，說明三氯乙酸是導致細胞色素C變性與聚合的重要因素之一，這為細胞色素C工藝優化與產品質量提高提供了理論依據與改進方向。