紫外誘變結合離子束誘變選育輔酶Q10高產菌株

焦雪茜，張 梁，胡柏藩，胡柏剡，丁重陽，石貴陽

(1. 江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122；2. 浙江新和成股份有限公司，浙江 新昌 312500)

輔酶Q10，別名泛醌(Ubiquinone)，是一種脂溶性天然抗氧化劑，作為呼吸鏈中重要的遞氫體主要分布于線粒體內膜上[1]，分子量為863.36，分子式為C59H90O4。輔酶Q10有還原型和氧化型之分，國內生產的主要是氧化型 Q10。輔酶Q10在醫(yī)藥、食品和化妝品等行業(yè)應用廣泛[2-6]。隨著輔酶Q10的應用領域不斷拓寬，市場需求逐年增長，其生產方法和工藝的開發(fā)和優(yōu)化引起了研究者的廣泛興趣。目前，產業(yè)化生產工藝主要有微生物發(fā)酵法、生物提取法、細胞培養(yǎng)法和化學合成法[7]，其中最主要的為微生物發(fā)酵法和茄尼醇合成法。輔酶Q10的全合成難度很大，如以香葉醇為原料，經多次耦合構建異戊二烯側鏈，再將側鏈銜接到輔酶Q10母核上，全合成得到輔酶Q10。全合成法工藝路線長，過程復雜，收率低，反應條件苛刻，很難實現(xiàn)產業(yè)化[8]。相比之下，發(fā)酵法生產輔酶Q10成本較低，有實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產的潛力。Yoshida等[9]通過對R.sphaeroidesKY-4113進行誘變得到一株綠色高產菌株Co-22-11，其產量達350 mg/L。與國外的研究相比，國內水平略有欠缺。吳祖芳等[10]通過對放射根瘤菌WSH2601在7 L發(fā)酵罐上進行發(fā)酵研究發(fā)現(xiàn)，輔酶Q10的最大產量達52.4 mg/L。李梅等[11]以CPU0402發(fā)酵輔酶Q10產量達87 mg/L。李繼揚等[12]通過耐受前體及結構類似物篩選到的高產菌株產量可達120 mg/L。

一般來說，輔酶Q10菌株的產量和傳代穩(wěn)定性較難同時滿足，并且若實現(xiàn)工業(yè)化生產，需進一步提高菌株的產量。離子束誘變技術借助離子輻照和單離子束精確定位輻照等物理平臺，結合現(xiàn)代分子生物學技術，已廣泛應用于改良微生物生產菌種。離子束誘變的原理可以概括為離子束能量傳遞、電荷傳遞、質量沉積等多種效應，從而使得受體目標體內遺傳物質發(fā)生改變。離子束誘變育種具有損傷輕、誘變范圍廣等優(yōu)點[13]。因此，通過誘變方法獲取產量和穩(wěn)定性均較為理想的菌株具有較強的現(xiàn)實意義。本文中，筆者對一株產輔酶Q10的菌株進行了紫外誘變及離子束誘變，以期篩選獲得較為理想的輔酶Q10高產菌株。

1 材料與方法

1.1 菌種

根癌土壤桿菌(Rhizobiumradiobacter)，保藏于江南大學生物資源與生物轉化研究室。

1.2 培養(yǎng)基與培養(yǎng)方法

斜面或平板培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨10，酵母膏10，NaCl 5，瓊脂20，pH 7.2；斜面或平板30 ℃培養(yǎng)24 h。

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖3，酵母膏5，(NH4)2SO43，KH2PO40.6，K2HPO40.4，NaCl 2，pH 7.2；250 mL種子瓶裝液量為30 mL，于30 ℃下200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30，(NH4)2SO44，玉米漿10，NaCl 2，KH2PO42，MgSO4·7H2O 3，pH 7.2；250 mL發(fā)酵瓶裝液量為30 mL，種子接種量4%，于30 ℃下200 r/min振蕩培養(yǎng)72 h。

1.3 誘變方法

1.3.1 紫外誘變方法

首先將對數(shù)生長期的菌體制成細胞密度為108個/mL的菌懸液，然后取菌懸液用紫外線照射，照射時間依需要調整。取誘變后菌懸液30 ℃避光培養(yǎng)，待菌長出后計算誘變致死率。

1.3.2 離子束誘變方法

將對數(shù)生長期的菌體制成細胞密度為109～1010個/mL的菌懸液，然后取菌懸液制成菌膜，放入離子注入機的靶室脈沖，注入能量為10 keV的N+，注入劑量根據(jù)實驗需要調整。

1.4 檢測方法

采用C18色譜柱(250 mm×4.6 mm)，流動相V(甲醇)∶V(無水乙醇)=1∶ 1；流速1 mL/min；檢測波長275 nm；柱溫34 ℃；進樣量20 μL。

2 結果與討論

2.1 快速篩選方法的確定

2.1.1 維生素K3(VK3)抗生素突變株的篩選

VK3是輔酶Q10的結構類似物，通過篩選抗VK3的突變株，可以解除輔酶Q10對合成途徑的反饋調節(jié)[14]。VK3是脂溶性物質，難溶于水，因此采用有機溶劑N，N-二甲基甲酰胺(DMF)對其進行溶解。

首先確定DMF對菌體生長的影響。將對數(shù)期的菌懸液涂布于DMF體積分數(shù)分別為0、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%、2.4%和2.8%的平板上，30 ℃培養(yǎng)。不同體積分數(shù)DMF對菌體生長的影響見表1。由表1可知：DMF體積分數(shù)在0～2.0%時對菌體的生長基本上沒有影響，而體積分數(shù)超過2.0%時會對菌體生長產生明顯抑制，因此，DMF的體積分數(shù)上限定為2.0%。

其次進行VK3最小抑制濃度的確定。將含有VK3的DMF母液加入到培養(yǎng)基中，制得VK3質量濃度在0～0.06 g/L的梯度平板，然后將對數(shù)期菌液涂布于上述平板，30 ℃培養(yǎng)，通過菌落生長情況確定抗性平板中VK3的臨界濃度，結果見表2。

表1 DMF濃度對菌體生長的影響

注：“+”代表有菌落生長，“+”的數(shù)量代表菌落數(shù)量的多少。

表2 維生素K3(VK3)對菌體生長的影響

注：“+”代表有菌落生長，“+”的數(shù)量代表菌落數(shù)量的多少 ，“-”代表無菌落生長。

由表2可知，當VK3質量濃度在0.02～0.035 g/L時，平板上有菌落生長，且隨著VK3濃度的增加，菌落數(shù)逐漸減少；當質量濃度達到0.04 g/L時，由于受到較高濃度VK3的抑制作用，平板上無菌落生長。因此，確定篩選抗結構類似物突變株所用抗性平板中VK3質量濃度為0.04 g/L。

2.1.2 糖苷類抗生素突變株的篩選

糖苷類抗生素可作用于呼吸鏈，因此可利用糖苷類抗生素一族里的丁胺卡那霉素和硫酸慶大霉素作為篩選因子，從而減少篩選的工作量，提高篩選效率。

首先進行丁胺卡那霉素(amikacin,Ami)最小抑制濃度的確定。取菌懸液涂布于含有0～35 mg/L Ami的平板上，以未加藥物的平板為對照，通過菌落生長情況確定最小抑制濃度，結果見表3。

表3 丁胺卡那霉素對菌體生長的影響

注： “+”代表有菌落生長，“+”的數(shù)量代表菌落數(shù)量的多少 ，“-”代表無菌落生長。

由表3可知，隨著Ami濃度的增加，菌體的生長受到抑制逐漸加重，當質量濃度達到25 mg/L時，沒有菌落生長。因此，確定Ami的最小抑制質量濃度為25 mg/L。

然后對硫酸慶大霉素(Gen)臨界濃度進行確定。取菌懸液涂布于含有0～9.6 mg/L Gen 的平板上，以未加藥物的平板為對照，通過菌落生長情況確定最小抑制濃度，結果見表4。

表4 硫酸慶大霉素對菌體生長的影響

注：“+”代表有菌落生長，“+”的數(shù)量代表菌落數(shù)量的多少 ，“-”代表無菌落生長。

由表4可知，隨著Gen濃度的增加，菌體的生長抑制逐漸加重，當質量濃度達到4.8 mg/L時，沒有菌落生長。因此，確定Gen的最小抑制質量濃度為4.8 mg/L。

2.2 誘變條件的確定

2.2.1 紫外誘變時間的確定

采用10、15、20、25和30 s這5組紫外照射時間對出發(fā)菌株進行紫外誘變，通過菌落計數(shù)得到誘變致死曲線(圖1)，并進行不同紫外誘變時間下的正負突變率計算(圖2)。由圖1和圖2可知，由于致死率過高或過低，誘變效果均不太理想。當誘變時間為15 s時，正突變率較高，而負突變率相對較低。因此，選擇致死率在80%～90%的15 s作為下一步的誘變時間。

圖1 不同紫外誘變時間下的致死率Fig.1 Lethality rate in different UV mutation times

圖2 不同紫外誘變時間下的正負突變率Fig.2 Positive and negative mutation rates in different UV mutation times

2.2.2 離子束注入劑量的確定

采用離子注入對微生物進行誘變育種是一種較為常見的誘變方法，脈沖注入能量10 keV的N+，注入劑量選擇2.5×1014、5×1014、10×1014、15×1014、20×1014、25×1014和30×1014ion/cm27組對出發(fā)菌株進行離子注入。通過菌落計數(shù)得到離子束誘變的存活曲線如圖3所示。

圖3 不同離子束注入劑量下的存活率Fig.3 Survival rate in different ion implantation

由圖3可以看出，存活率隨著注入劑量的增加急劇下降，當注入劑量大于5×1014ion/cm2時，存活率又開始緩慢增加，20×1014ion/cm2時存活率達到一個相對較高的點，隨之又緩慢下降，存活曲線基本符合先下降后上升再下降的“馬鞍型”。

隨機挑選各個注射劑量的平板上長出的菌落，通過搖瓶發(fā)酵瓶檢測輔酶Q10的產量，對它們的突變率情況進行了統(tǒng)計，結果見圖4。

圖4 不同離子束注入劑量下的突變率Fig.4 Mutation rate in different ion implantation

由圖4可知，大多數(shù)劑量下，菌株的負突變率較正突變高，而5×1014和20×1014ion/cm2這兩個劑量下菌株的正突變率卻較高。參照存活率曲線，正突變較高時恰好為存活曲線的兩個拐點。相比之下，高劑量離子束對微生物作用更加劇烈，突變率也較高，產生期望結果的幾率相對更大。因此，選擇20×1014ion/cm2作為進一步誘變的劑量。

2.3 誘變及篩選結果

2.3.1 第一輪紫外誘變

將紫外照射15 s的菌懸液涂布含有VK3的抗性平板，待菌落長出后挑選了125株菌進行搖瓶發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)深綠色菌落產量較高，隨著菌落顏色變淺，輔酶Q10的產量也隨之降低。因此，也可以將菌株的顏色作為一種初篩的手段，從而減少篩選的工作量(由于此項工作工作量很大，太多圖片就不附在文章里)。經過初篩和復篩得到一株產量相對較高、編號為10-18的菌株(78.1 mg/L)作為下一步誘變的出發(fā)菌株K-1，與出發(fā)菌株K-0(63.7 mg/L)相比，產量提高了22.6%。

2.3.2 第二輪紫外誘變及離子束誘變

將菌株10-18制成菌懸液，紫外照射15 s，適當稀釋后涂布含有丁胺卡那霉素和硫酸慶大霉素的抗性平板(兩種平板分別標記為Amir和Genr)，在Amir平板上挑取了52株菌，通過初篩和復篩，得到4株相對高產菌株K-2、K-18、K-52、K-53，其中編號為K-53的菌株產量達到了101.1 mg/L。對Genr平板上挑取的56株菌進行初篩和復篩，得到高產菌株Q-18、Q-34、Q-40和Q-52，其中編號為Q-18的菌株產量最高為104.7 mg/L。上述篩選結果見表5。出發(fā)菌株編號為K-0。

表5 紫外誘變獲得Amir和Genr高產菌株

由表5可知，經過兩次紫外誘變，并結合VK3和糖苷類抗生素的抗性篩選，輔酶Q10的產量有了較大幅度的提高。其中，篩選得到的具有VK3抗性(VK3r)+Amir的突變株K-53與VK3r+Genr的突變株Q-18產量與出發(fā)菌株相比分別提高了58.7%和64.4%。由于兩種篩選方法均有明顯效果，因此，按上述方法繼續(xù)誘變和篩選應該能夠進一步提高出發(fā)菌株的產量。并且，篩選具有Amir和Genr雙重抗性的突變株也是今后工作的重點。

菌株10-18預處理后脈沖注入能量為10 keV的N+，注入劑量為20×1014ion/cm2。平板培養(yǎng)后，挑取256株菌，通過搖瓶初篩和復篩，得到4株編號為Y80-58-2、Y80-88-1、G60-43-1、Y60-42-2的高產菌，結果見表6。與10-18(78.1 mg/L)相比分別提高了35.5%、25.7%、24.6%和24.2%。

表6 離子束誘變高產菌株

2.3.3 高產菌株誘變選育譜系及傳代穩(wěn)定性實驗

通過不同的誘變方法相結合，分別獲得了K-53、Q-18、和Y80-58-2這3株較高產的輔酶Q10產生菌株，高產菌株誘變圖譜如圖5所示。將上述3株菌株在斜面上連續(xù)轉接5代，并將各代的菌株搖瓶發(fā)酵檢測輔酶Q10的產量，結果如圖6所示。圖6表明各代輔酶Q10的產量基本穩(wěn)定，說明K-53、Q-18和Y80-58-2的遺傳穩(wěn)定性較好。

圖5 Rhizobium radiobacter BnSO1 誘變高產 菌株的選育譜系Fig.5 Mutation breeding of coenzyme Q10 high-yield strains from Rhizobium radiobacter BnSO1

圖6 傳代穩(wěn)定性實驗結果Fig.6 Experiment results of passage stability

綜上可知，采用結構類似物和糖苷類抗生素作為篩選因子較為可行，既達到了預期的目的，又降低了篩選的工作量。紫外線和離子束雙重誘變獲得的突變株Y80-58-2產量達105.8 mg/L，比單純使用紫外誘變產量高，且傳代穩(wěn)定，這也提示筆者在以后的工作中，需要更多的采用復合誘變的方法。盡管本工作所采用的方法較理想地實現(xiàn)了預期目的，但是建立更有效的高通量篩選方法，以及如何進一步提高產量，仍需要筆者付出更大的努力。

3 結論

通過紫外誘變和離子束誘變篩選輔酶Q10高產菌株，根據(jù)所建立的篩選方法，成功地獲得了3株高產菌株。首先對出發(fā)菌株進行紫外誘變獲得了具有維生素K3抗性的突變株10-18，產量提高了22.6%。繼續(xù)對10-18紫外誘變，又獲得了具有丁胺卡那霉素抗性的突變株K-53和具有硫酸慶大霉素抗性的突變株Q-18，產量分別提高了58.7%和64.4%。同時對10-18采用N+離子束誘變，得到的一株突變株Y80-58-2，產量為105.8 mg/L，與出發(fā)菌株相比產量提高了66.1%。最后從搖瓶小試結果看，本階段工作獲得的突變株產量在國內處于中等以上水平。優(yōu)化篩選方法，并且通過全自動發(fā)酵罐實時控制發(fā)酵條件提高產物產量是筆者下一步的工作重點。