光遺傳學工具的開發及其應用研究

魏琪瑤，徐晨晨，王美艷，葉海峰

生物工程與大健康

葉海峰 華東師范大學研究員、博士生導師。2007–2013年于瑞士蘇黎世聯邦理工學院(ETH Zurich) 從事博士和博士后研究工作。2013年被授予ETH Zurich最高榮譽獎章“ETH Silver Medal”。2014年入選國家“青年千人計劃”。2015年獲國家自然科學基金“優青”項目資助。擔任中國生物工程學會合成生物學專業委員會委員、中國生物工程學會青年工作委員會委員、上海市生物工程學會第七屆理事會理事、上海市生物工程學會合成生物學專業委員會副主任委員。主要從事合成生物學與生物醫學工程領域的研究。主要研究內容為光遺傳學與疾病治療、代謝疾病智能診療器件、腫瘤免疫治療智能診療器件、合成生物學與再生醫學。相關研究成果以第一或通訊作者身份發表在、(2篇封面)、、(2篇) 等期刊。申請發明專利10項。

光遺傳學工具的開發及其應用研究

魏琪瑤，徐晨晨，王美艷，葉海峰

華東師范大學 生命科學學院 上海市調控生物學重點實驗室 華東師范大學醫學合成生物學研究中心，上海 200241

細胞所處微環境的動態變化對細胞分化、細胞信號通路、個體生長以及疾病等有很大影響。光遺傳學技術利用基因編碼蛋白質表達并結合光控的手段為動態調控細胞信號通路、細胞定位和基因表達等方面提供了一種全新、無損、可逆、非侵入、時空特異性的研究手段。文中總結了光遺傳學元件的類型以及涉及的細胞信號通路，并探討了光控細胞信號通路的應用與未來發展前景。

合成生物學，光遺傳學，光控信號轉導，光控基因開關，時空特異

細胞自身雖然會產生胞內信號動態變化，但環境的動態變化使細胞接受刺激會隨著時間、空間變化作出響應，從而影響胞內信號的動態變化。觀察信號通路的動態變化對于信號通路研究有極大的幫助。經典的信號通路研究常常通過基因的抑制/沉默或是過表達以觀察信號通路的變化[1]。但這樣的研究僅涉及單一條件下的調控，如不同基因表達調控直接導致的胞內信號網絡改變的靜態結果，而無法研究目標通路在時間或空間動態變化下的調控過程。此外，利用小分子藥物或蛋白配體進行的調控由于擴散困難以及脫敏效應等原因而無法實現精確調控。相比之下，光控在時間、空間、強度各方面都具備極大優勢。

光遺傳學元件的引入推動了人們對于光響應蛋白的研究，它們一般來自植物、真菌、水母、珊瑚、細菌和藻類等[2-4]。光控研究最早在神經科學中被應用，被稱為光遺傳學。光遺傳學是指結合光學與遺傳學手段，精確控制特定神經元活動的技術。科學家們將光敏蛋白通過基因融合引入細胞，利用光控系統調控神經活動，在亞細胞水平定位蛋白活動，調控蛋白功能，促進或抑制基因表達，或者誘導蛋白降解 (圖1)[5]。

然而，當下光遺傳學的定義已經有所擴展，并不局限于神經科學領域，科學家們可以利用和改造多種類型的光敏蛋白控制細胞的活動。光敏蛋白響應特定波長的光，經過一系列構象改變、蛋白間可逆結合以及聚合反應，驅動特異性生理反應，包括 (去) 激活特異性蛋白活動、激活或抑制轉錄、亞細胞定位、局部活性氧生產和其他功能 (表1)。隨著光遺傳學研究的發展，科學家們在體外到體內、細胞組織到動物個體或群體等不同水平引入改造的光控開關進行研究，加深了對生物體微觀機理以及相應生物功能的挖掘與理解，因此光遺傳學元件的研究將推動著生物學一系列領域的共同發展。

1 光遺傳學工具

近年來，光遺傳學工具被廣泛應用于人工改造信號通路，成為細胞信號轉導中重要的調控元件。光控蛋白主要可分為兩大類：視蛋白依賴光受體(Opsin-based photoreceptor) 和光敏蛋白 (Photosensitive protein)。視蛋白 (Opsin) 是一種光敏跨膜蛋白，廣泛存在于各種生物中，根據其分布特點可分為Ⅰ型微生物類和Ⅱ型脊椎/非脊椎動物類[6]。光敏蛋白屬于非視蛋白依賴光遺傳學元件，其分子機制是通過吸收激發光的光子能量導致構象變化或者促進蛋白質之間的互作與 重排[7]。

圖1 光遺傳學元件的工作示意圖

表1 光遺傳學元件的基本原理

Abbreviations: aa, amino acid; FAD, flavin adenine dinucleotide; FMN, flavin mononucleotide; λ, wavelength; Ta1/2, half-life of association; Td1/2, half-life of dissociation; *endogenous.

對光反應蛋白新功能的擴展將進一步拓寬其應用范圍。雖然最佳光反應蛋白的設計取決于實際需求，但它們有一些共性特點：1) 易于被遺傳編碼和表達；2) 光響應活性具有較大的動態變化范圍，且在黑暗條件下幾乎沒有或僅有較低的背景噪音；3) 對細胞內源性蛋白功能和亞細胞定位造成的影響小；4) 光激活波長具備特異性和快速反應性。根據不同作用機理，我們將光敏蛋白分為以下幾類。

1.1 光控二聚化系統

1.1.1 光敏色素

植物光敏色素是一類可響應紅光調節植物生長發育的蛋白。在種子植物中有兩類光敏色素——Ⅰ型和Ⅱ型。目前在擬南芥中已發現5種屬于Phy家族的蛋白 (PhyA–PhyE)[15]。其中光敏色素A (PhyA) 是唯一一種Ⅰ型光敏色素，其在光照條件下降解，在黑暗條件下積累[16]。區別于其他紅光激活的Ⅱ型Phy蛋白，PhyA在716–720 nm遠紅光條件下被激活，并在與遠紅光受體伴侶蛋白FHY1 (Far-red elongated hypocotyl1) 或FHL蛋白 (FHY-LIKE) 相互作用下轉運入核[17]；在紅光條件下，核內的重組蛋白解聚，PhA被重新循環至胞漿[18](圖1A)。

在Ⅱ型光敏色素中，紅光是最有效的響應觸發光，其工作機理已被深入研究且被廣泛應用于合成生物學領域。以光敏色素B (PhyB) 為例，其包含兩個主要的結構域：N端光吸收結構域和C端效應結構域[19]。光敏色素二聚系統的局限在于Phy的發色團PCB不能在哺乳動物細胞內自然合成[20]，需要外源引入。但與PhyA不同的是，PhyB通過結合轉錄因子PIF或自身核定位信號入核，不需要運輸蛋白。在紅光照射下PCB介導PhyB可逆構象變化從而結合光敏色素互作因子PIF (圖1A)。同時在遠紅光 (760 nm) 照射下可以抑制PhyB與PIF的結合[21]。

光敏色素不僅存在于植物中，近年來科學家們發現細菌中也存在類似的光敏色素。2016年，Vladislav V Verkhusha課題組Kaberniuk等[8]在沼澤紅假單胞菌中發現了細菌光敏色素BphP1可與天然配體PpsR2可逆結合 (圖1B)，建立了近紅外光調控系統。與Phy/PIF系統相比，其優點是所需色素PCB在哺乳動物細胞內天然存在，無需額外引入。BphP1-PpsR2光控系統對740–780 nm近紅外光敏感，650 nm紅光可以促進BphP1與PpsR2蛋白分離。但只有在完全黑暗的條件下，兩蛋白才完全分離[8]。該系統可用于調控基因表達、細胞信號轉導、細胞形變與時空控制等[22-23]。但其實驗數據表明，該BphP1-PpsR2系統調控基因表達效率較低，限制了其廣泛應用。因此后期該課題組Redchuk等[23]科學家對PpsR2蛋白進行人工截短改造從而獲得更小的PpsR2變體QPAS1，通過將BphP1-QPAS1系統與藍光調控元件AsLOV2的LOV結構域結合，建立了藍光與近紅外光分別獨立調控的胞內蛋白定位系統。

1.1.2 隱花色素

隱花色素 (Cryptochrome) 最早在擬南芥中發現，主要參與光調節細胞伸長、開花的光周期等。隱花色素2 (CRY2) 是一種藍光響應蛋白，其天然結合配體為具有螺旋-環-螺旋結構的CIB蛋白。在光激活條件下，CRY2與CIB形成二聚物，并且在黑暗條件下二聚體解聚 (圖1C)。同時Kennedy等[9]發現，CRY2蛋白中N端光裂合酶同源區域 (PHR) 與光響應結合CIB緊密相關，其在藍光調控下可與缺失螺旋-環-螺旋結構的CIB1 (CIBN) 或全長CIB1發生聚合或解聚作用。Taslimi等[24]發現一些CRY2的截短版本：CRY2 (515) 與CRY2 (535)，可以很大程度地降低黑暗條件下二聚作用產生的本底；L348F 與 W349R位點的突變分別可以減緩或加強CRY2-CIB1二聚物的解聚。此外在藍光條件下高表達的CRY2蛋白自身可發生寡聚[24-25]。

1.1.3 紫外響應受體8

UVR-8 (UV response locus 8) 也是一種光敏蛋白，其作為植物UV-B響應信號通路的組成部分，幫助植物適應自然生長過程中的UVB (Ultraviolet B, 280–315 nm)，并緩解UV-B產生的DNA損傷[26-27]。相較于其他光敏蛋白，UVR-8的優點在于，它通過色氨酸殘基吸收UVB，激活不需要共因子[28]，但其劣勢在于不可逆性以及UV的較強光毒性和細胞損傷能力。在黑暗條件下，UVR-8以同型二聚體形式存在，而光形態建成調控因子 (COP1) 是一種E3泛素連接酶，通過結合降解UVB響應轉錄因子阻遏紫外響應作用的產生；在UVB存在條件下，UVR-8解聚為單體轉運到核內，結合COP1的C端WD-40結構域并釋放COP1轉錄結合因子，該過程是不可逆的[29-31](圖1D)。

1.1.4 變構蛋白

變構蛋白二聚化或解聚也可應用于光誘導蛋白互作，一般情況下依賴于LOV結構域。光-氧-電勢結構域 (LOV) 最早是從植物光電感受器phot1中分離出的閉鎖結構域 (Caging domain)，通過響應藍光調控植物生長[32-33]。

黑暗條件下AsLOV2 (LOV2) 或AtLOV2 (LOV2) 結構域與C末端螺旋Jα結合；藍光激活條件下，由于半胱氨酸殘基的高度保守，使LOV核心與黃素蛋白FMN之間的非共價作用轉變為共價作用，由此發生光誘導構象變化，解除Jα螺旋結構對LOV核心結構域的抑制作用[34-35](圖1E)。因此可以通過在LOV結構域N端或Jα螺旋的C端融合效應蛋白，調控藍光釋放原來閉鎖在LOV結構域中的目的蛋白，從而將該系統應用于光控信號通路的改造[36]。此外，Strickland等[37]通過理性設計在AsLOV中引入4個突變位點，增強了Jα螺旋LOV結構域結合的穩定性。

雖然以上天然含有LOV結構域 (光-氧-電結構域) 的光受體蛋白本身就具有藍光誘導異構的能力[26]，但大部分情況下使用的是經過人工改造的具有多重異構結構域的變構蛋白。它可以感應光從而對下游通路產生影響。如TULIP系統利用LOV結構域響應藍光發生構象變化，釋放目標蛋白誘導二聚化的產生[38-39]。此外，LOV結構域相關的光遺傳學工具開關的開啟和關閉靈敏度取決于蛋白融合，對融合的方向和連接蛋白的長度較為敏感。

在真菌的光受體中，VVD是最小的含有LOV結構域的蛋白，其N端螺旋結構在光刺激的條件下發生空間構象變化[40]，導致同源二聚化從而在空間上使互相作用的結構域靠近。但天然同源二聚化具有局限性且解聚半衰期長[10,41]，因此后續通過改造VVD蛋白，在其N末端螺旋處加上正電性氨基酸 (pMag) 與負電性氨基酸 (nMag)利用藍光激活LOV結構域，釋放pMag與nMag殘基，誘導正負電性的氨基酸相互吸引發生異源二聚化 (圖1F)；而該系統中帶同種電荷氨基酸殘基之間存在相互排斥，因此可以很大程度上消減自然情況下的同源二聚化作用[10,42]。

此外，離子通道相關的光遺傳學元件在機制上也屬于變構蛋白，其蛋白種類主要屬于Ⅰ型微生物類視蛋白家族，常應用于神經光遺傳學領域調控神經元功能[4]。例如ChR2 (Channelrhodopsin-2)是一種光門控非特異性陽離子通道，可由藍光介導使Na+、Ca2+、K+等陽離子泵入細胞內，Deisseroth課題組將其用來控制神經元活動[43-44](圖1G)。此外，Kushibiki等通過在小鼠胰腺β-細胞中表達ChR2，建立了β-細胞分泌胰島素的光依賴通路，并證明利用藍光激活ChR2通道誘導胞內儲存的Ca2+釋放內流到小鼠胰腺β-細胞中，產生信號級聯，可調節體內血糖水平[45]。

1.2 寡聚系統

隱花色素CRY2PHR除了可與其結合蛋白CIBN在藍光刺激下發生二聚作用以外，2013年，Bugaj等[25]發現CRY2自身具有寡聚作用 (圖1H)，并且在10 s內即在動物細胞中產生肉眼可見的蛋白質聚集，蛋白聚集量隨著光照強度的增強與光照時間的增長而增多；在黑暗條件下，CRY2蛋白聚集隨時間指數級減少，半衰期小于5.5 min。

該CRY2寡聚系統可應用于時空調控目的蛋白同源寡聚化，從而探究蛋白間相互作用以及細胞信號通路；并且該寡聚系統的穩定與否直接與CRY2蛋白濃度以及標記蛋白的種類和結構相關[46]。2017年，Park等[47]通過與CRY2融合表達不同的熒光蛋白發現融合蛋白或標記蛋白的四級結構對CRY2的寡聚效率存在顯著影響，并且利用短肽標記構建了穩定高效的CRY2聚合系統 (CRY2clust)，該系統能夠有效地調控活細胞在對光的響應過程中的精確胞內信號。但目前該系統CRY2蛋白寡聚機理仍未被揭示，并且無法有效應用于分子量較大的蛋白寡聚化調控，因此，該系統仍有很大的探索空間。

2 光控細胞信號通路

在細胞的增殖、分化、衰老、凋亡等生理過程中，細胞信號通路起著主要調控作用且介導細胞執行一系列生物功能。細胞信號通路的相關研究是目前生物科學研究的主流，且功能性蛋白和信號網絡間的互作關系的探究已獲得一定成果與進展。然而，傳統研究方法在空間與時間上缺乏靈活調控且應用面較為狹隘，因此導致細胞信號通路的探究仍具有很大局限性。

通過合成生物學手段人為構建改造的胞內信號通路，在原有信號通路中引入光遺傳學元件來替代胞內響應蛋白和基因或作為額外的調控因子感受和響應外界刺激，可實現時空特異性的調控，也可通過光控蛋白調控多元信號通路探索信號網絡間的聯系。采用光遺傳學改造胞內信號通路的應用已被廣泛報道，其關鍵是選擇合適的元件進行調控，以下舉例闡述幾條主要的胞內信號通路以及光遺傳學工具在通路改造中的應用。

2.1 絲裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 通路

絲裂原活化蛋白激酶 (Mitogen-activated protein kinase，MAPK) 通路及其引起的一系列信號級聯效應調控著細胞增殖、分化、凋亡等生理過程。MAPK的信號級聯在胞內可被大量的細胞表面受體激活，如受體酪氨酸激酶 (RTK)、細胞因子受體和G蛋白偶聯受體 (GPCRs)；并且該信號級聯主要由MAPK3K、MAP2K和MAPK相互激活、產生信號放大效應[48]。

MAPK信號通路相關的光遺傳學改造最早以酵母為底盤細胞，成功實現了藍光調控膜招募支架蛋白Ste5，從而激活下游一系列MAPK信號級聯效應，在生物功能上表現為對酵母生長的抑制[38,49](圖2A)。在動物細胞中，Toettche等[50]建立了紅光響應的Opto-SOS系統，通過引入光控系統PhyB-PIF (光敏色素互作因子) 從而招募SOS至細胞膜，實現紅光誘導激活MAPK信號級聯反應 (Ras/Raf/MEK/ERK) (圖 2B)。

此外，藍光調控系統CRY2-CIBN也被應用于Raf/MEK/ERK信號通路的改造，該系統中CIBN定位于細胞膜，CRY2PHR與Raf1融合表達，通過藍光激活調控蛋白CRY2PHR與CIBN二聚化招募Raf1激酶靶向細胞膜，從而激活下游激酶[51](圖 2C)；Kim等則通過在FGFR (成纖維細胞生長因子受體) 上引入可響應藍光發生寡聚化的CRY2PHR蛋白，改造并建立了Opto-FGFR1系統。在藍光激活條件下，FGFR二聚化并自磷酸化，從而對下游MAPK、PI3K、PLC等激酶產生影響，在Opto-FGFR1系統中表現為對FGFR受體的調控從而調控細胞的極化與遷移[52-53]。

圖2 光控蛋白與細胞信號通路

2.2 細胞凋亡信號通路 (Caspase cascade)

程序性細胞死亡 (Programming cell death，PCD)，又稱凋亡，是一種由基因編碼的存在于所有細胞中的信號通路，在死亡信號介導下誘導細胞主動有序地生理性死亡。細胞凋亡是維持細胞內穩態的關鍵，凋亡通路的失調可能導致許多疾病，如癌癥、自身免疫病和神經退行性疾病等，因此對于細胞凋亡通路的人為調控也是突破癌癥等疾病治療的關鍵所在[54]。

在PCD過程中，半胱氨酸-天冬氨酸蛋白水解酶 (Caspase) 是決定性的調控因子，根據不同的Caspase家族可分為執行者和效應者，對凋亡通路的級聯起著重要作用。Mills等[55]通過引入LOV2結構域，構建了藍光響應Opto-caspase-7系統，非激活狀態下LOV2閉鎖的空間結構抑制caspase-7活性，藍光照射下誘導LOV2結構域構象變化釋放caspase活性，并且系統可以在1 h內高效地引起細胞凋亡過程。Zheng等[56]通過將稀土上轉換發光納米顆粒 (UCNPs) 與藍光調控系統CRY2-CIB相結合，建立了受紅光間接調控的凋亡途徑，實現調控凋亡通路下游一系列Caspase級聯效應用于腫瘤治療(圖2D)。但該系統中光轉換納米顆粒存在潛在的不穩定性與不可估測性，因此在臨床腫瘤治療中還存在諸多待解決問題。

2.3 磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路 (PI3K/AKT)

PI3Ks激酶可以使磷脂酰肌醇磷酸化從而產生PIP3，PIP3則可激活下游相關通路AKT、PKC、Rac/actin來調節細胞生長、生存、遷移和細胞周期等過程[57-58]。同時控制著胞內多條重要的生存信號級聯反應的AKT信號通路，其中蛋白激酶B (AKT/PKB) N端的PH結構域響應膜上PIP3水平的變化，隨著PIP3水平的上升，PKB被激活并引發一系列細胞效應如細胞遷移極化、增殖和分化[59]。

利用光遺傳學方法改造的PI3K/AKT通路目前已分別在紅光系統與藍光系統中實現。紅光調控的PI3K/AKT通路通過利用光遺傳學元件PhyB-PIF6，引入融合表達的PIF6因子與PI3K結合蛋白p85α的SH2結構域，從而在紅光條件下膜招募SH2結構域，進而招募PI3K激酶，上調PIP3水平并激活下游AKT通路[60](圖2E)。Chang等[61]利用藍光響應蛋白CRY2的寡聚效應，將TrkB (原肌球蛋白受體激酶B) 與CRY2PHR (CRY2光解酶同源區域) 融合表達構建了Opto-trkB系統 (圖2F)，實現AKT/PI3K等酶表達水平的上調。此外，CRY2-CIB1系統也被用于改造PI3K/AKT信號通路，目前已建立了Opto-ish2、Opto-5-磷酸酶等系統，可分別用于調控網格蛋白介導的內吞作用以及細胞骨架的重組[62]。

2.4 Rho家族GTP酶相關通路

Rho家族GTP酶是真核細胞中調控多條信號轉導通路的分子開關，可以誘導細胞極化，調控微管動力學、膜運輸通路、細胞器發育等，其中GTP酶最主要的生物功能是調控肌動蛋白細胞骨架的形成[63]。目前研究最為廣泛的3種GTP酶分別為Rac1、Cdc42和RhoA，且它們之間的調控作用存在著非常緊密的聯系——Cdc42可激活Rac1，Rac1與RhoA互相拮抗[64]，3個酶對細胞骨架動力學調控具有重要影響。

光控Rho GTP酶系統的激活主要依賴于鳥苷酸交換因子 (GEFs) 的光響應膜招募過程，通過將光敏蛋白PhyB錨定于胞膜，融合表達PIF與多種GEFs (Rac1/Cdc42/Rho) 從而構建Opto-GTPase，在紅光調控下產生一定生物效應，如Tiam蛋白(Rac GEF) 與交叉蛋白 (Cdc42 GEF) 的招募促進細胞產生板狀與絲狀偽足，Tim蛋白 (Rho GEF) 的膜招募可誘導細胞體積的收縮[7]。Yazawa等[65]利用擬南芥的FKF1-GI蛋白建立了藍光激活二聚化系統 (BLAD)，可招募小G蛋白Rac1至細胞膜，同時誘導光照區域局部形成板狀偽足 (圖2G)。此外，LOV-PDZ以及LOV變構系統 (LOV uncaging system) 也被應用于Rho GTP酶的改造[11,37-38]。

2.5 STING信號通路

干擾素刺激因子 (Stimulator of interferon genes, STING)，也稱為MITA或MPYS，由TMEM 173基因編碼，是一種與內質網 (ER) 相關的信號分子，可識別細胞質內異常DNA或環狀二核苷酸 (CDNs)，從而調控激活多種宿主防御基因的轉錄，其中包括Ⅰ型干擾素 (IFNs) 和促炎癥細胞因子等[66-68]。早期研究表明，STING是人類天然免疫中的一種新分子，可響應入侵的DNA病毒、細菌以及轉染的DNA，從而激活內源免疫相關基因的轉錄[69-70]；進一步研究發現STING可作為環二核苷酸傳感器 (cGAMP，c-di-GMP，c-di-AMP)，通過cGAMP合成酶 (cGAS) 介導合成cGAMP，從而可以檢測胞漿DNA及胞內病原體釋放的第二信使 (c-di-AMP，c-di-GMP)[71]。STING被激活后在TKB1激酶 (Tank-binding Kinase 1) 介導下分別使干擾素調節因子3 (Interferon-regulatory Factor 3, IRF3) 與核因子 (Nuclear factor-κB, NF-κB) 磷酸化，從而使這些轉錄因子入核激活下游內源基因轉錄[72-73]。

2014年，Folcher等[74]通過改造STING通路，利用腦電圖腦-機接口BCI (EEG-based brain-computer interface) 開發了光誘導連接的無線電植入裝置來調控分泌型堿性磷酸酶SEAP (Secreted alkaline phosphatase) 的表達。該人造STING通路包含的元件有紅光響應的細菌BphG1突變體蛋白、細菌二鳥苷環化酶DGCL結構域 (Diguanylate cyclase)以及STING受體蛋白，可用于檢測細胞內c-di-GMP水平并調控干擾素IFN-β啟動子激活，驅動特定轉基因的轉錄 (PIFN(AC+)-SEAP-pA) (圖2H)。

2017年，本課題組利用合成生物學技術將STING通路改造為光控信號通路，利用干擾素基因刺激因子 (STING) 作為細胞內環二核苷酸傳感器的原理，采用細菌光敏蛋白BphS (c-di-GMP合酶) 以及c-di-GMP的專一磷酸二酯酶YhjH調控信號通路[75-77]，將IFN的響應元件 ((hIFN-RE)- (ISRE)3) 作為GLP-1和Insulin的啟動響應元件，建立了遠紅光響應的GLP-1和Insulin分泌系統用于糖尿病治療[76](圖2H)。但該系統的弊端在于對內源性STING通路的嚴格依賴，系統易與人體免疫的重要內源性過程 (如環鳥苷的激增) 產生交叉干擾，在應用上有潛在不可控性。因此，我們后續改進并提出了正交性更強、調控性能更好的改進系統，詳見3.3。

3 光控細胞信號通路的應用

生物體的發展高度依賴于空間和時間的信號級聯與基因表達的調節，一個信號分子的定位可能引發細胞不對稱分裂或向組織層的特異性遷移，特定時間的基因表達也可能決定細胞分化過程中的命運，異常的時空變化產生的信號配體或基因表達可能是癌癥、遺傳性相關疾病的基礎。通過光遺傳學工具能夠精確了解到至少刺激多少特定種類的神經元才能啟動目標生物體，并能確定神經元對特定神經遞質永久脫敏的信號劑量或持續時間；同時光遺傳學工具具備精確調控目標通路的空間、時間和強度的能力。因此，光遺傳學工具在細胞信號通路中的引入能夠在多種基礎研究如神經生物學 (調控神經興奮的發生、突觸可塑性研究)、基因修飾與調控、干細胞再生與分化、細胞信號通路和蛋白定位等研究中提供定制化的技術支持，并能夠突破傳統研究的限制，推動其他相關領域的技術發展，如光感蛋白的發現，顯微技術、成像技術和微創技術的發展等。此外，目前已經解析了異常的細胞信號通路變化與疾病間聯系，而如何實現精確調控細胞信號通路將基礎研究的成果轉化到醫學領域，光控細胞信號通路可能會成為這一突破的關鍵所在。

3.1 光控在神經生物學研究中的應用

光遺傳學最早就被應用于調控神經興奮，而實現對突觸的調控是也光遺傳工具目前應用最深入的研究領域[78]。2005年，Karl Deisseroth等在哺乳動物神經元中引入ChR2，實現了藍光光照下1 ms內引發單個神經興奮和一系列神經興奮，在當時引起了巨大的轟動。由此衍生出的研究工作也被廣泛報道，如全息光學刺激視網膜神經節細胞恢復視力[79]以及光遺傳學工具在測量微秒級亞細胞電生理的發展等。2019年Claire N. Bedbrook[80]等結合機器學習建立計算機模型從而改造了大量ChR變體，其中變體ChRger1、ChRger3展現出優良的神經系統的光遺傳學激活，尤其ChRger2無需光纖植入即可實現神經元的光遺傳學激活，初步解決了哺乳動物顱內光遺傳學外源電子元件植入帶來的問題。

3.2 光控系統在基因表達調控中的應用

光遺傳是一種能夠實現時空特異性地調控基因表達 (轉錄、翻譯和基因編輯) 的強大工具。不同于傳統的擴散性高、控制性低的化學誘導劑，特殊波長的光觸發基因調控系統能夠實現精確正交調控，且無明顯脫靶效應。Shimizu-Sato等[81]通過在光敏色素上融合Gal4-DNA結合域 (Phy-GBD)，在Gal4-DNA激活域上融合PIF3 (PIF3-GAD)，實現在紅光照射下Phy-GBD結合PIF3-GAD融合蛋白，從而在Gal4啟動子控制下刺激基因轉錄；遠紅光則能關閉轉錄。Ravi S Kane等[82]利用CRY2PHR-CIBN蛋白在藍光下使翻譯激活蛋白eIF4E定位至目標mRNA，從而激活其翻譯過程。

然而上述方法都存在一個限制因素：需要向胞內基因外源引入復雜的啟動子區域。近期，光控研究也被用來招募效應器到內源性基因組位點而應用于基因轉錄調節和基因組編輯。Polstein等[83]利用Gigantea和FKF1相互作用的光控系統，引入鋅指結構DNA結合蛋白 (Zinc finger protein，ZFP) 以招募VP16轉錄激活子至目標DNA序列，并在藍光下開啟轉錄過程。Konermann等[84]設計了利用轉錄激活因子類似效應器DNA結合域和轉錄激活子VP64結合構建的CRY2-CIB1光控系統，實現修改組蛋白乙酰化，從而展現出其潛在的協調表觀遺傳狀態和翻譯后修飾的功能。

雖然調控基因表達的Cre/、CRISPR/Cas9等系統能夠高效調控基因表達，但想要對系統進行更加精確的調控，實現在時間、空間上特異性調控基因表達，光遺傳學元件給了人們很多啟發。

3.2.1 光控Cre系統調控基因表達

Cre/系統來源于F1噬菌體，能夠介導位點特異的DNA重組。該系統含有兩種組分：位點 (Locus of X-over P1) 和Cre重組酶 (Cyclization recombination)。位點作為重組酶識別的位點，是一段長34 bp的DNA序列，含有兩個13 bp的反向重復序列和一個8 bp的核心序列；Cre重組酶是一種由343個氨基酸組成的單體蛋白，生物活性較穩定，能在生物體不同的組織內、不同的生理條件下引發位點的DNA重組。Cre/系統不需要細胞或者生物體提供其他的輔助因子，重組酶的編碼基因受響應啟動子調控。

近期Won Do Heo課題組開發了一種高度光敏和高效的光活化Flp重組酶 (PA-Flp)[85]，可用于體內基因調控。該系統中重組酶PA-Flp可由病毒載體介導與Cre-系統結合，形成Flp依賴性Cre表達系統，可同時激活Flp和Cre；并且實驗證明了PA-Flp依賴性、Cre介導的內側隔膜中的Cav3.1沉默增加了小鼠的物體探索行為。PA-Flp是非侵入性的、高效的、易于使用的光遺傳模塊，其高度光敏特性能通過無創發光二極管照明激活小鼠大腦深部區域，為神經科學研究提供了無副作用和可擴展的基因操作工具[86]。

3.2.2 光控CRISPR/Cas9系統調控基因編輯

CRISPR/Cas9系統是細菌在長期演化過程中為了對抗入侵的病毒及外源DNA而形成的一種適應性免疫防御[87]。在利用CRISPR/Cas9進行基因編輯過程中，可以通過外源導入Cas9和sgRNA對靶基因進行剪切從而實現基因定點敲除、突變或敲入。

有關光響應的CRISPR/Cas9基因編輯方式已經有了很多報道。如單體無活性的Split Cas9系統可融合光開光蛋白pMag和nMag后在光照下使Cas9活性重組[88]。2018年Felix Bubeck等利用LOV2藍光元件，引入了李斯特菌原噬菌體中的AcrIIA4蛋白作為效應蛋白改造了抗CRISPR變體 (Anti-CRISPR)。在藍光刺激下，該CASANOVA系統可以很容易地在Cas9抑制狀態和活性狀態之間進行精確地外部切換，可用于研究活細胞中Cas9 DNA靶向定位的動力學。

光控的Cas9系統改變了過去單向的、不可控的基因編輯，實現了時空特異性的、非侵入性的、可控的基因編輯模式，擴展了基因編輯工具箱。

3.2.3 光控CRISPR/dCas9系統調控基因表達

dCas9是Cas9突變 (D10A和H840A) 后失去核酸酶活性的蛋白，但其仍具有結合基因組的能力，因而將dCas9與其他效應蛋白融合可用于內源基因修飾、調控以及DNA位點的標記等[89-90]。為了實現特定時間、特定細胞的基因調控表達，Cas9或dCas9系統被不斷優化。近幾年里很多化學藥物調控dCas9系統不斷被提出，但多數化學藥物調控存在藥物擴散難以控制、反應速度慢、反應效率低、毒性大、無法滿足時空特異性和可逆調控的問題。而光在時間、空間、強度各方面都能很容易地實現調控，因而能夠很好地解決化學藥物調控存在的一些問題。一些光響應蛋白對特異性波長光觸發的基因調控系統能夠實現精確正交調控。

近期研究已經開發了光響應的CRISPR/dCas9基因編輯方式。2015年有研究報道[75]，dCas9介導的藍光響應系統被用于靶向內源基因組位點調控其轉錄。融合CIB1的dCas9在sgRNA引導下靶向內源基因組位點，融合轉錄激活子的CRY2在藍光響應下與CIB1結合，從而調控目標基因轉錄。靶向內源基因修飾和轉錄表達的光響應系統在近幾年已經有較多的研究報道[91-92]。

3.3 光控系統在干細胞研究中的應用

光遺傳學元件也可應用于干細胞的改造，通過內源性轉錄因子組成的通信網絡控制細胞的可塑性、多能性，并且該網絡可持續對內環境與信號作出反應從而重調細胞類型特異性基因表達[92-93]。傳統干細胞的誘導需要一系列生長因子的激活，其過程低效、復雜且可重復性低，通過光遺傳學手段在基因或信號水平控制分化關鍵基因可有效解決該問題。例如Sokolik等[94]利用藍光響應VVD結構域的二聚化，上調神經分化因子Brn2的表達，高表達的Brn2可競爭性抑制Oct4、促進Sox2上調從而誘導神經分化基因的表達[94-95]。本課題組通過引入外源光敏蛋白 (BphS)以及相關響應蛋白 (BldD)，構建了完全絕緣的遠紅光響應的人造基因回路調控轉錄激活子，進而構建了遠紅光調控的CRISPR-dCas9系統 (Far-red light-activated CRISPR-dCas9 effector, FACE)[96]。該系統可高效誘導內源或外源基因表達，通過上調單個神經轉錄因子有效促進多能干細胞向功能神經元的分化。此外，利用干細胞改造原理建立人工改造腫瘤干細胞樣細胞 (CSC)，其中天然CSC細胞是誘導腫瘤復發的關鍵因素，通過光遺傳系統調控Sox2、OCT4、KIf4和c-Myc的表達可以控制分化細胞轉化為iCSC，可應用于篩選CSCs靶向藥物，為進一步研究腫瘤藥物抗性以及腫瘤再生提供技術支持[97-99]。

3.4 光控細胞信號通路與疾病治療

隨著合成生物學技術的發展，基因治療與細胞治療成為了新一代藥物研發的潛力股。通過結合光遺傳學方法與合成生物學理念而建立的精準治療的創新體系，能夠改善傳統藥物或基因治療的失準或脫靶效應，并且現已有多種體系實現了以光為調控因素，在體外與體內水平達到較好的時空特異性與細胞行為學調控[100-101]。此外，通過結合交叉領域生物電子藥物技術與原理，從而系統性地將分子生物學、細胞生物學、生物工程、電子信息技術串聯一體，建立智能化藥物診療體系。目前，光控細胞信號通路在癌癥、糖尿病以及神經性疾病 (見3.1) 等重大疾病中都有良好的進展。

在癌癥治療方面，近幾年來免疫療法如過繼細胞療法等技術迅速發展，在多種癌癥治療的臨床應用中呈現出顯著療效，但傳統細胞療法存在組織特異弱、穿透性差等局限[102-104]。而引入光遺傳學系統可以精確調控免疫細胞有效識別腫瘤特異性抗體從而消除腫瘤細胞；應用特定光譜的光遺傳學工具，可以一定程度上提高組織穿透能力，有效解決了傳統細胞療法存在的問題。He等[105]建立了Opto-CRAC系統 (光控鈣離子釋放-激活鈣離子通道)，通過引入響應藍光發生構象變化的LOV2結構域來模擬基質互作分子 (STIM) 自然體內構象變化的過程，從而通過光誘導LOV2釋放STIM與膜上CRAC蛋白ORAI1結合，產生Ca2+并且介導免疫細胞內一系列特征性鈣依賴反應 (圖3A)[106-107]。該系統除了可用于精確控制CAR-T細胞中的Ca2+/NFAT信號；引入Opto-CRAC系統改造的細胞與小鼠模型都呈現樹突狀細胞加速成熟且抗原遞呈能力上調的特點，從而促進T細胞活化[105]。另一基于CAR-T (Chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy) 治療的光控系統PA-CXCR4，利用趨化因子受體與光響應視紫紅質之間的結構與功能關系，通過505 nm光激活誘導產生胞內趨化因子的信號，控制T細胞遷移與運輸 (圖3A)。Xu等通過體外實驗證明經過PA-CXCR4改造的CD8+T細胞在光照條件下，能顯著減緩腫瘤細胞增殖[108]。此外2019年Molly E Allen等[109]引入邏輯門-“與”門，設計了TamPA-Cre系統。通過將藍光響應蛋白 (pMag,nMag) 與他莫昔芬 (Tamoxifen) 依賴性核定位結構域整合Split-Cre重組酶，構建了藥物小分子他莫昔芬與藍光共同調控嵌合抗原受體的表達，實現CAR-T細胞的特異性調控，進一步改善了CAR-T治療脫靶的問題。

影響著全球約4.6億的不死“癌癥”——糖尿病，其引起的一系列并發癥以及慢性疾病的無法根治性帶來的痛苦不亞于腫瘤[110]。糖尿病治療的傳統手段是通過嚴格的飲食控制和終生注射胰島素 (Ⅰ型糖尿病) 或GLP-1 (Ⅱ型糖尿病) 來實現血糖穩態的控制。目前運用合成生物學思路建立的光控糖尿病治療系統已實現。2011年，本課題組[111]構建了藍光調控光遺傳學裝置來調控血糖內穩態，通過在細胞中異位表達藍光響應G蛋白偶聯受體黑視素 (Melanopsin)，在藍光響應下可以介導一系列胞內信號級聯磷酸化激活轉錄因子NFATs，因此該系統可以通過光控NFAT控制特異性GLP-1啟動子來驅動GLP-1的轉錄與表達。華東理工大學楊弋課題組[96]構建了另一光控胰島素分泌的系統，利用藍光激活下LOV蛋白VVD結構域二聚化，通過將DNA結合結構域Gal4 (1–65) 與VVD結構域、轉錄激活結構域VP16融合表達構建了GAVV。藍光條件下GAVV二聚化從而入核結合啟動子Gal啟動胰島素的轉錄與表達。近期Zhang等[112]將光敏腺苷酸環化酶 (PAC) 引入胰腺β細胞中，通過藍光激活上調胞內cAMP水平，從而增強葡萄糖刺激胰島素分泌過程 (Glucose-stimulated insulin secretion, GSIS) 來實現控制血糖穩態。

圖3 光控細胞信號通路的改造應用

為了解決藍光組織透性低、光毒性較大、體內應用局限性大等問題，本課題組[76]成功構建了一種遠紅光調控轉基因表達的控制開關。利用紅細菌中響應遠紅光的受體蛋白BphS作為感受器, BphS在遠紅光照射下可產生c-di-GMP分子。進一步設計合成了c-di-GMP調控的雜交型轉錄激活子p65-VP64-BldD及其相對應的啟動子，最終獲得了遠紅光調控基因表達的光控基因線路 (圖3B)。最后通過利用合成生物學、光遺傳學、電子軟件工程等多學科交叉技術，巧妙地開發了一種集糖尿病診斷和治療為一體的半自動化診療新系統 (圖4)。首次實現通過智能手機APP超遠程調控胰島素表達就能實現遠程控制血糖穩態的目的。這一研究將為糖尿病患者提供極大的便捷性，顛覆了傳統口服和注射藥物治療糖尿病的方法。這種通過無線信號超遠程控制藥物精準釋放的電子藥物膠囊系統將是未來電子藥物的新趨勢。

圖4 人工改造光控信號通路應用于精準化治療、干細胞誘導分化、藥物篩選的示意圖

4 總結與展望

光控細胞信號通路的研究對現代生物學具有深遠意義。目前，光控改造細胞信號通路的應用已擴展到實現控制蛋白質與蛋白質的相互作用、觀察信號網絡動態、上調或下調基因表達或蛋白活性、亞細胞定位甚至走向轉化醫學與疾病治療的道路。

時空特異性是光遺傳學工具的最大優勢，這一特性恰好彌補了傳統研究方法中的缺點和劣勢。但是，光控系統也不是完美無缺，目前主要面臨著移植元件的組織損傷性、光毒性以及光控特異性與高效性等問題。盡管現有的手段已經在不斷降低元件植入的創傷，但仍無法完全忽略創口給實驗或是臨床應用帶來的影響。同時，應用在活體生物內時，需要考慮不同光遺傳學工具對應不同光譜，其組織穿透能力的差異也是一個極大的影響因素。此外，在照射細胞一段時間后，光毒性仍是一個需要考慮的因素。而且光響應蛋白的大小、特性對光遺傳學工具的開發也均有著很大的影響。

針對以上問題，為了實現更加安全精準的調控，光遺傳學工具的開發目標應集中于研發設計更為精確、智能化的控制手段，例如結合顯微技術、醫學影像技術、軟件工程、電子信息工程等交叉領域實現宏觀元件對微觀分子水平的高效調控。近年來結合交叉領域優化光控系統在一定程度上改善了光控的部分問題。一方面，光學元件、軟件編程和電子信息技術的發展為可控光源提供了技術支持[113-117]；動物手術和臨床手術技術的不斷優化使微創成為可能；另一方面，一些靈敏度高、響應強烈以及毒性低、組織穿透性強的光控系統也不斷地被開發出來[118-119]。值得關注的是，近幾年來研究者們在嘗試整合多個光發生系統實現多方向、多方面地調控細胞信號網絡。利用不同波長的光設計構建的多個光調控系統將能用來探索兩個信號通路、一個通路中的兩個節點或多個蛋白激活的組合、順序或正交激活的下游效應等[120]。

近年來光遺傳學領域在工具開發和擴展方面有了很大的發展，為細胞在不同空間和時間的動態變化的研究提供了新的研究手段，也為細胞信號通路的基礎研究提供了強有力的技術支持，對未來在轉化醫學方面的研究也有著廣闊的應用前景。

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Development and application of optogenetic tools

Qiyao Wei, Chenchen Xu, Meiyan Wang, and Haifeng Ye

Biomedical Synthetic Biology Research Center, Shanghai Key Laboratory of Regulatory Biology, School of Life Sciences, East China Normal University, Shanghai 200241, China

Dynamic variations of the cell microenvironment can affect cell differentiation, cell signaling pathways, individual growth, and disease. Optogenetics combines gene-encoded protein expression with optical controlling, and offers a novel, reversible, non-invasive and spatiotemporal-specific research tool to dynamically or reversibly regulate cell signaling pathways, subcellular localization and gene expression. This review summarizes the types of optogenetic components and the involved cellular signaling pathways, and explores the application and future prospects of the light-controlled cell signaling pathways.

synthetic biology, optogenetics, light-controlled signal transduction, light-controlled gene switch, spatiotemporal control

July 4, 2019;

November 29, 2019

The National Key R&D Program of China (No. 2016YFA0100300), the National Natural Science Foundation of China (Nos. 31971346, 31861143016, 31870861), the Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (No. 18JC1411000), the Thousand Youth Talents Plan of China.

Haifeng Ye. Tel: +86-21-54341058; E-mail: hfye@bio.ecnu.edu.cn

科技部重大專項基金 (No. 2016YFA0100300)，國家自然科學基金 (Nos. 31971346, 31861143016, 31870861)，上海市科委 (No. 18JC1411000)，青年千人計劃資助。

2019-12-05

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.q.20191203.1645.001.html

魏琪瑤, 徐晨晨, 王美艷, 等. 光遺傳學工具的開發及其應用研究. 生物工程學報, 2019, 35(12): 2238–2256.

Wei QY, Xu CC, Wang MY, et al. Development and application of optogenetic tools. Chin J Biotech, 2019, 35(12): 2238–2256.

(本文責編 郝麗芳)