抗生素混合使用對C57BL/6J小鼠腸道菌群破壞的研究

王悅縈，粟雨芯，李方琳，李凌浩，馬忠仁*

(1.西北民族大學 生物醫學研究中心 生物工程與技術國家民委重點實驗室，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030)

抗生素主要是由細菌、霉菌或其他微生物產生的次級代謝產物或人工合成的類似物[1]。一般情況下，合理正常的使用抗生素不會對其宿主產生嚴重的副作用[2-4]。但濫用抗生素，會導致腸道菌群微環境失調，會對人體健康造成巨大危害。據報道，腸道菌群及其代謝產物的的不良變化與人類的多種疾病相關，包括慢性炎癥反應，II型糖尿病，動脈粥樣硬化，慢性腎病，以及精神疾病等[5-7]。本研究通過建立腸道菌群失衡的小鼠模型，旨在讓人們重視抗生素濫用的危害性，并提醒人們在以后的生活中合理使用抗生素[8-14]。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

本實驗所選用實驗動物為C57BL/6J小鼠（中國科學院蘭州獸醫研究所）；所選用的飼料為普通小鼠飼料（南通特洛菲生物有限公司）。抗生素：桿菌肽；慶大霉素；環丙沙星；新霉素；青霉素；甲硝唑；硫酸鏈霉素；萬古霉素；頭孢他啶；上述所用試劑均購自阿拉丁生物試劑有限公司。培養基;滅菌無纖維羊血(北京索萊寶科技有限公司)、瓊脂培養基。

1.2 實驗方法

1.2.1 適應階段 本實驗所用小鼠為六周齡雄性C57BL/6J小鼠（n=14），在12 h光暗循環的無特定病原體動物房（SPF級）中飼養，正常飲食一周后開始試驗。

1.2.2 抗生素破壞小鼠腸道菌群 所有小鼠平均分為兩組，對照組（n=7）和實驗組（n=7）。對照組正常飲食和飲水；實驗組小鼠的飲用水為抗生素溶液（具體含量如下: 新霉素100 μg /ml、鏈霉素50 μg /ml、青霉素100 μg /ml，萬古霉素 50 μg /ml、甲硝唑100 μg /ml、桿菌肽1 mg/ml、環丙沙星125 μg /ml、頭孢他啶100 μg /ml,慶大霉素170 μg /ml），并每周更換一次抗生素混合溶液，共4周。試驗前后，采集小鼠體重及收集小鼠新鮮糞便。

1.2.3 血平板培養實驗 為確認小鼠腸道菌群數量變化，故做小鼠糞便血平板培養試驗。首先收集小鼠的新鮮糞便于經過高壓滅菌的1.5 ml離心管中，然后用無菌生理鹽水將糞便配制成10%的糞便混合溶液，吸取上清液涂于5%的羊血瓊脂平板上，所有小鼠的糞便血平板均分為有氧和無氧兩種培養環境培養。最后將所有血平板放置在37℃的CO2培養箱中培養，12 h后計算每個血平板上面的落數并記錄。

1.2.4 小鼠空腹血糖的測量 在實驗進行的第0天和第30 d，分別對小鼠進行空腹血糖的測量。所有小鼠在測量前空腹8 h，用血糖儀測量并記錄。

2 結果與分析

2.1 腸道菌群失衡后對小鼠糞便中微生物數量的影響

在小鼠的腸道內有多種微生物，微生物菌落的數量變化可以顯示抗生素對小鼠腸道菌群的破壞程度。因此，在實驗的第0天和30天分別收集實驗組和對照組小鼠的糞便樣品，對其分別進行有氧培養和無氧培養。結果如圖所示，圖1、圖2表示實驗組和對照組在第0天小鼠的糞便樣品，分別取0.1 mg進行有氧培養和無氧培養，并對其培養12 h，最后對血平板上的菌落進行計數。結果顯示，實驗組和對照組的小鼠體內均有菌落，符合實驗預期。為了對上述結果進一步驗證，本研究還選取了0.05 mg的糞便樣品進行血平板培養，結果如圖3、圖4所示，結果同樣顯示，實驗組和對照組的小鼠體內均有菌落，符合實驗預期。

在第30天，收集的糞便樣品取0.1mg進行有氧培養和無氧培養，并在培養12 h以后對血平板上的菌落進行計數（如圖5、圖6）。結果表明，實驗組和對照組的菌落數在統計學上有顯著差異。作為對照，在實驗中稱取了0.05 mg的糞便樣品進行血平板培養，結果如圖7、圖8所示，結果同樣顯示，實驗組和對照組的菌落數在統計學上有顯著差異。因此，得出結論，在30天的時間里，對實驗組小鼠的腸道菌群進行抗生素干擾后，小鼠的腸道菌群明顯下降，說明抗生素對小鼠的腸道菌群有破壞作用。圖9表示在30天時實驗組和對照組的血平板培養圖，結果表明實驗組血平板培養后肉眼觀察不到菌落，而對照組長出很多菌落，以上數據均表明抗生素對小鼠的腸道菌群有很大的破壞作用。

圖1 0天有氧培養結果(0.1mg樣本)

圖2 0天無氧培養結果(0.1mg樣本)

圖3 0天有氧培養結果(0.05mg樣本)

圖4 0天無氧培養結果(0.05mg樣本)

圖5 30天有氧培養結果(0.1mg樣本)

圖6 30天無氧培養結果(0.1mg樣本)

圖7 30天有氧培養結果(0.05mg樣本)

圖8 30天無氧培養結果(0.05mg樣本)

圖9 30天時血平板培養實驗結果

2.2 腸道菌群失衡對小鼠空腹血糖的影響

小鼠在第0天測得的空腹血糖結果如圖10所示，通過Graph pad軟件對兩組小鼠的空腹血糖進行分析，在實驗開始前沒有統計學差異。在第30天對14只小鼠的空腹血糖再次進行測量，結果如圖11所示。通過Graph pad軟件對兩組小鼠的空腹血糖進行分析，在實驗結束時兩組結果具有統計學差異，且實驗組空腹血糖低于對照組，這種結果可能與腸道菌群的破壞、菌群代謝產物的變化及腸道消化吸收能力的變化有關，但具體原因，還應該經過進一步的實驗來證明。

圖10 0天空腹血糖結果

圖11 30天空腹血糖結果（ *：p＜0.05）

3 討論

抗生素飼喂小鼠30天后，無論經過有氧還是無氧培養小鼠體內的腸道菌群，實驗組小鼠體內的腸道菌群數量均顯著減少，這說明不僅是菌群的豐度還是獨立種屬的數量，都發生了顯著的改變，這說明小鼠的腸道菌群被破壞。另外，經過抗生素干預的小鼠的血糖值和對照組也有顯著差異，這說明血液等其他指標很有可能由于腸道菌群遭到破壞而發生了變化，這對機體健康會造成危害。腸道微生物群的組成中的不良變化和多種疾病相關，包括慢性炎癥反應，類風濕性關節炎，動脈粥樣硬化，慢性腎病，以及精神疾病等?？股貫E用是導致這種現象發生的重要因素。