昆蟲細胞無血清培養基的研究

王家敏，馬桂蘭，馮玉萍，馬 偉，馬 祺，馬忠仁，喬自林*

（1.西北民族大學 生物醫學研究中心 甘肅省動物細胞技術創新中心，甘肅 蘭州 730030；2.蘭州百靈生物技術有限公司，甘肅 蘭州 730010；3.西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030）

桿狀病毒表達系統（Baculovirus Expression Vector System，BEVS）是以桿狀病毒為載體，在昆蟲細胞上表達外源蛋白的真核表達系統。由于昆蟲桿狀病毒系統能高水平地生產異源蛋白質，而且能保證異源蛋白質的生物活性并應用于醫療診斷、疫苗生產方面。目前已上市的利用昆蟲桿狀病毒表達系統生產的疫苗有豬瘟疫苗、豬圓環病毒2型疫苗、宮頸癌疫苗和治療性前列腺癌疫苗等。另外，2013年美國FDA 批準了Flublok用于19至49歲人群季節性流感的預防，Flublok也成為第一個用昆蟲桿狀病毒表達系統的流感疫苗[1-3]。

隨著昆蟲細胞體外培養的需求，昆蟲細胞培養基的研發勢在必行。本研究以Gibco生產的Grace’s Insect Medium培養基為基礎，經改良后用于Sf-21和Hi-five細胞的懸浮培養的無血清培養，該培養基成分明確，支持Sf-21和Hi-five細胞全懸浮生長且狀態良好，可為我國昆蟲細胞培養技術提供無血清培養基。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 貼壁培養型Sf-21及Hi-five細胞從CCTCC引進，引進后由甘肅省動物細胞技術創新中心經懸浮馴化后保存。

1.1.2 主要試劑及儀器 Grace’s Insect Medium干粉 (Gibco)，葡萄糖（國藥集團），水解乳蛋白（HyClone），Pluronic F-68（Gibco），酵母粉（Organotechnie），0.2%臺盼藍（Sigma）、倒置相差顯微鏡（CK40-32PH型，Olympus），細胞計數儀（CASY TT型，INNOVATIS），電子天平（AR2140型，上海奧豪斯），搖床（2102C型，上海智誠），pH計（MP120-BLE型，梅特勒）等。

1.2 方法

1.2.1 昆蟲細胞無血清培養基的制備 濃度50倍的酵母粉濃縮液配制：稱取200g酵母粉溶解到500 ml注射用水中，反復攪拌后置2～8℃冰箱，過夜后取出再加500 ml注射用水充分攪拌后用單層普通濾紙過濾后備用。

Grace’s Insect Medium配制：配制4.9 L溶液，其中各種溶質的用量為5 L溶液時溶質的用量（先不加碳酸氫鈉）。

將以上兩種培養基合并到一起攪拌后，加入30.75 g葡萄糖、13.5 g水解乳蛋白、200 ml濃度50倍的酵母粉濃縮液和20 g PF68，攪拌后再加12.752 g碳酸氫鈉后充分混勻，調pH值到6.16，過濾除菌在2～8℃保存備用。

1.2.2 Sf-21、Hi-five細胞無血清懸浮培養 取細胞密度達到2×106/ml以上、對數生長期的Sf-21、Hi-five細胞，按6.0×105/ml的初始密度分別接種上述培養基分別接種，不添加血清，置27℃，100 rpm搖床培養，每24 h取樣，顯微鏡下觀察細胞狀態，細胞計數儀計數細胞密度，連續培養三代，繪制三個代次細胞平均值的生長曲線。

2 結果

2.1 昆蟲細胞無血清培養基的制備

培養基是Grace’s Insect medium培養基基礎，添加葡萄糖、水解乳蛋白、酵母粉溶液和PF-68等組份，溶解性好，液體透明，呈微黃色。

2.2 Sf-21、Hi-five細胞無血清懸浮培養

配制的培養基分別無血清培養Sf-21、Hifive細胞，細胞生長均較好，能夠很好的全懸浮生長。其中，Sf-21細胞最高密度可達（39.8±2.6）×105/ml，Hi-five細胞最高密度可達（44.4±1.0）×105/ml，細胞計數結果見表1，生長曲線見圖2，細胞形態見圖1。

圖1 昆蟲細胞無血清培養基懸浮培養狀態（A: Sf-21細胞 B: Hi-five細胞）

圖2 無血清培養基培養兩種昆蟲細胞的生長曲線

表1 兩種昆蟲細胞無血清懸浮培養三代計數結果

3 討論與結論

目前成分穩定且廣泛應用的商品化基礎培養基有Grace′s、IPL-41和TC-100，使用時通常要加10%的牛血清和4g/L酵母浸出液才能正常培養，由于使用時添加動物血清增加了生物安全的風險和下游純化工藝。無血清培養基主要有Thermo Fisher Scientific公司的Sf-900?SFM、Express Five? SFM 和 HyQ SFX-Insect，LONZA公司的Insect-XPRESS?，Sigma-Aldrich公 司 的 EX-CELL? 405、420和 TiterHigh?Medium等。這些產品均為國外公司生產，由于中國沒有相應的產品競爭，外國公司給中國用戶的賣價很高，如1L包裝的液體EX-CELL?405給中國用戶的直銷價為650元，導致工業用戶生產成本太高產品沒有競爭優勢[4,5]。Grace’s Insect medium是一種基礎培養使用時加血清和酵母浸出液才能維持昆蟲細胞生長，價格約為進口商品化無血清培養基的一半左右。

本研究以基礎培養基Grace’s Insect medium為基礎，添加了葡萄糖、水解乳蛋白、酵母粉溶液和PF-68等組份后可較好的支持Sf-21、Hi-five兩種昆蟲細胞懸浮生長，為昆蟲細胞培養提供了一種價格相對便宜無血清懸浮培養基，為我國利用昆蟲細胞桿狀病毒表達系統生產生物制品提供培養基的支持。