藏藥甘青虎耳草總黃酮對小鼠抗炎作用的研究

崔 瑋，曾巧英

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.河西學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 張掖 734000)

炎癥反應(yīng)是機(jī)體最基本的抗損傷反應(yīng)，但給機(jī)體也帶來很多傷害，如引起關(guān)節(jié)炎、哮喘以及機(jī)體失調(diào)，因此抗炎藥應(yīng)運(yùn)而生。但臨床應(yīng)用的抗炎藥物存在很多問題，如引起胃部不適、增加心臟病發(fā)作的危險(xiǎn)率等[1]。黃酮類化合物是許多中草藥的有效成分,具有許多生物活性[2]，近年來有關(guān)其在抗炎、調(diào)節(jié)免疫、抗衰老作用方面的研究較多[3,4]。

甘青虎耳草（Saxifraga tangutica Engl.）為虎耳草科植物。生于海拔2 600～4 900 m的青藏高原－喜馬拉雅地區(qū)。藏族人民常用它們治療肝膽類疾病，并稱之為 “松蒂，其味苦性寒，具有清肝膽濕熱，排膿斂瘡之功效，臨床上多用于肝炎、膽囊炎、感冒發(fā)熱及熱毒瘡癰等的治療[5]。據(jù)有關(guān)資料表明甘青虎耳草中黃酮類生物活性物質(zhì)較豐富。但有關(guān)甘青虎耳草極其黃酮抗炎的研究未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)提取甘青虎耳草中的黃酮類化合物，通過小鼠耳腫脹試驗(yàn)、小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性試驗(yàn)以及小鼠棉球肉芽腫試驗(yàn)探究甘青虎耳草黃酮對小鼠的抗炎作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要藥品與試劑 甘青虎耳草購于青海西寧，生理鹽水，95%酒精，氨芐青霉素鈉（80萬單位），0.7%冰醋酸，0.1%伊文思蘭，地塞米松（1ml/5mg）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康昆明種小鼠，8～10周齡，體重在20～21g，由蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物合格證號為：甘醫(yī)動(dòng)字第14—006。

1.2 方法

1.2.1甘青虎耳草黃酮的制備 甘青虎耳草（Saxifraga taugutica Engl.）全株購自青海塔爾寺藏醫(yī)院。將甘青虎耳草烘干、粉碎，石油醚浸泡除脂后用70%乙醇超聲破壁，減壓濃縮后加乙酸乙酯萃取，萃取液減壓濃縮后凍干。凍干粉用蒸餾水溶解、AB-8大孔樹脂吸附，先用去離子水洗脫除雜，再用 90% 乙醇洗脫，洗脫液濃縮后異丙醇洗 2 次，過濾并濃縮，加入甲醇除雜，最后得棕黃色的甘青虎耳草黃酮。以蘆丁作對照，硝酸鋁法測得提取物中黃酮的純度為 82.07%。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組及用藥 昆明種小鼠分為甘青虎耳草黃酮低劑量組、中劑量組和高劑量組（分別灌胃50 mg/kg、100 mg /kg、200 mg /kg的甘青虎耳草黃酮），地塞米松組（灌胃10mg /kg的地塞米松）和空白對照組（灌胃生理鹽水）。

1.2.3 小鼠皮下棉球肉芽腫試驗(yàn) 小鼠隨機(jī)分為五組，每組六只，分別為虎耳草總黃酮溶液低劑量組（50 mg/kg）、中劑量組（100 mg /kg）、高劑量組（200 mg /kg）、地塞米松組（10mg /kg）、空白對照組，分開飼養(yǎng)。而后用氨基甲酸乙酯20% 腹腔注射0.02 ml進(jìn)行麻醉 ,在腹部剪毛消毒切一個(gè)小口向兩側(cè)腹股溝下各植入一個(gè)5.0 mg重的滅菌棉球,從手術(shù)次日連續(xù)給藥7 d ,給藥方式及劑量按表1所示。第8 d 拉頸處死小鼠,切開腹部皮膚,將棉球連同周圍的肉芽組織一起取出,剔除脂肪組織,放在已寫好編號的培養(yǎng)皿里的濾紙上,置于60 ℃干燥箱烘干24 h ,精確稱取重量,減去棉球重量即為肉芽組織增生的重量。按照以下公式計(jì)算肉芽組織重量。

1.2.4 伊文斯藍(lán)法測定小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性試驗(yàn) 小鼠分組處理同表1。最后一次給藥1 h后在每只老鼠尾靜脈注射伊文思藍(lán)0.01ml/g，隨即腹腔注射0.7%冰醋酸0.1 ml/10g。20 min后拉頸處死小鼠剪開腹部，暴露腹膜，用10 ml生理鹽水充分沖洗腹腔，收集腹腔液，3 000 r/min離心10 min，收集上清液，在紫外分光光度計(jì)590 nm波長處測得OD值，以O(shè)D值表示腹腔液中的伊文思藍(lán)含量。

1.2.5 二甲苯致小鼠耳腫脹試驗(yàn) 小鼠分組處理同表1。最后一次給藥20 min后在每只老鼠的左耳上涂上0.02 ml二甲苯致炎，致炎后拉頸處死小鼠，剪下小鼠的左右耳，并用打孔器在兩耳的相同部位打下同樣大小的耳片，精確稱重按照以下公式計(jì)算鼠耳腫脹率、耳腫脹度以及腫脹抑制率。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘青虎耳草總黃酮對小鼠棉球肉芽腫的影響[6]

由圖1可知，與空白組比較，甘青虎耳草總黃酮中、高劑量組和地塞米松組均有顯著性差異；與地塞米松相比，虎耳草總黃酮低、中劑量組有顯著性差異，而高劑量組無顯著性差異。說明中、高劑量組均可以明顯抑制小鼠棉球肉芽腫的發(fā)生，但高劑量的效果好于中劑量，而低劑量不能抑制小鼠棉球肉芽腫。綜上所述，表明虎耳草總黃酮的高劑量組和中劑量組能顯著抑制小鼠棉球肉芽腫。

圖1 甘青虎耳草總黃酮對小鼠棉球肉芽腫的影響

2.2 甘青虎耳草總黃酮對毛細(xì)血管通透性的影響[6]

由圖2可知，甘青虎耳草總黃酮高劑量組和空白組比較差異顯著，與地塞米松組比較差異不顯著，說明高劑量組和地塞米松能明顯抑制小鼠毛細(xì)血管通透性增加。中劑量組和空白組相比較差異較顯著，與地塞米松組比較差異也顯著，說明中劑量組可以抑制小鼠毛細(xì)血管通透性增加，但效果沒有地塞米松明顯。低劑量組和空白組相比較差異不顯著，與地塞米松差異顯著，說明低劑量組不能抑制小鼠毛細(xì)血管通透性增加。

圖2 虎耳草總黃酮對毛細(xì)血管通透性的影響

2.3 甘青虎耳草總黃酮對小鼠耳腫脹的影響[7]

由表1可知，甘青虎耳草總黃酮中、高劑量組和空白組比較差異較顯著，空白組和地塞米松相比較差異不顯著，表明中、高劑量組和地塞米松組都明顯減輕二甲苯所致小鼠的耳朵腫脹，腫脹抑制率達(dá)到65.29%和75.29%。甘青虎耳草總黃酮低劑量組與空白組相比較差異顯著，與地塞米松組相比較差異也顯著，說明低劑量給藥也能顯著減輕二甲苯所致小鼠耳腫脹，但效果明顯比地塞米松效果差，腫脹抑制率僅為21.76%。可見甘青虎耳草總黃酮中、高劑量可以顯著抑制二甲苯所致小鼠耳朵腫脹。

3 討論

炎癥是一種極為常見而又十分重要的病理過程, 是人類賴以生存的防御性和保護(hù)性反應(yīng).其基本病理變化表現(xiàn)為局部微血管反應(yīng)和血液成分的滲出, 組織和細(xì)胞的變形, 壞死以及增生和修復(fù)[8]。

二甲苯是一個(gè)無色透明液體物質(zhì)，毒性比較大，其作用機(jī)理是因?yàn)樗稍黾用?xì)血管的通透性，根據(jù)毛細(xì)血管和組織間存在的靜態(tài)平衡關(guān)系來分析，因?yàn)槊?xì)血管通透性增高，那么滲入組織的液體就增多，也就是肉眼看到的紅腫現(xiàn)象[9]。在小鼠的左耳上涂上二甲苯所有小鼠的耳朵都不同程度的出現(xiàn)紅腫，空白組的最明顯。通過稱重分析表明虎耳草總黃酮中劑量組（100 mg /kg）和高劑量（200 mg /kg）可以明顯抑制二甲苯所致小鼠耳朵腫脹。

醋酸促進(jìn)小鼠毛細(xì)血管通透性增加，尾靜脈注射伊文思藍(lán)，腹腔注射醋酸后，小鼠腹腔伊文斯藍(lán)的滲出增多，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示甘青虎耳草黃酮高劑量組（200 mg /kg）伊文思藍(lán)的滲出量明顯減少。

棉球作為異物植入小鼠皮下后，會(huì)刺激機(jī)體產(chǎn)生與臨床某些炎癥后期相似的病理變化，即形成肉芽組織[9]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示高劑量組（200 mg /kg）可以明顯抑制小鼠棉球肉芽腫的產(chǎn)生。

綜上所述，甘青虎耳草黃酮具有一定的抗急、慢性炎癥作用，但其抗炎機(jī)理還需進(jìn)一步深入研究。

表1 甘青虎耳草黃酮對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響