重組腺病毒載體Ad- EGFP- Klotho構建的實驗研究*

賈 政,劉 茜,邢正江,鄒弘麟,李亞雄△,魏 玲,韋 杰,李春城,孟凡棣

(1.昆明醫科大學附屬延安醫院心臟大血管外科/云南省心血管外科研究所,昆明 650051；2.昆明醫科大學附屬延安醫院老年醫學科,昆明 650051；3.中國人民解放軍聯勤保障部隊第920醫院干部病房,昆明 650032)

Klotho基因于1997年首先由KURO- O等[1]在自發型高血壓相關研究時發現，Klotho基因僅在部分器官表達，比如腦、心、腎、唾液腺等。研究表明，Klotho基因可以抑制經典型瞬時電位受體 (transient receptor potential canonical- 6,TRPC- 6)、胰島素樣生長因子(insulin- like growth factor,IGF)信號轉導通路，改善內皮功能，增加一氧化氮(NO)活性并調節離子通道活性，增強機體抗氧化應激能力[2]。給予外源性Klotho或誘導內源性Klotho過表達對于鈣磷異常代謝、內皮功能障礙、心肌纖維化等疾病發揮保護作用，可能成為其治療的有效方法。據此，本研究以大鼠Klotho基因為目的基因，利用AdMaxTM腺病毒包裝系統構建了綠色熒光蛋白(EGFP)標記的重組腺病毒表達載體，為相關疾病的基因治療提供依據，現報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1質粒、菌株與細胞 本科室構建含有Klotho基因和EGFP基因的重組質粒，并向深圳百恩維生物科技有限公司購買AdMaxTM腺病毒包裝系統、穿梭質粒pDC316- mCMV和骨架質粒，JM109感受態細胞及HEK293細胞由本科室保存。

1.1.2實驗試劑 ExTaq酶、限制性內切酶NheⅠ、限制性內切酶NotⅠ及T4 DNA 連接酶均購自美國New England BioLab公司；Qiagen大規模質粒抽提試劑盒購自德國Qiagen公司；Polyfectin脂質體、DMEM培養基、胰蛋白酶- 乙二胺四乙酸(EDTA)消化液(0.25%)、胎牛血清(FBS)、凝膠EDTA回收試劑盒購自美國Invitrogen公司;DNA引物合成、DNA測序均為美國Invitrogen公司；ViraBind腺病毒純化試劑盒購自美國Cell Biolabs公司；Trans2K Plus Ⅱ DNA Marker和去內毒素小量質粒抽提試劑盒購自北京全式金生物科技有限公司；RNAiso Plus、GoScriptTMReverse Transcription System試劑盒、Go Tap?qPCRMsater Mix購自美國Promega公司。

1.2方法

1.2.1引物設計 根據NCBI GenBank中大鼠Klotho mRNA編碼序列(NM_031336.1)報告，應用Prime primer5.0軟件設計特異性引物：上游5′- CTA CAG CAT CCG ACG AGG AC- 3′，下游5′- AGC AAA GTC ACA GGG AAA CG- 3′，在每條引物的前端加入相應的限制性內切酶位點和保護性堿基，選取NheⅠ(CAT ATG)和NotⅠ(GCG GCC GC)兩個酶切位點。

1.2.2重組穿梭質粒pDC316- mCMV- EGFP- Klotho的構建及鑒定 同時用內切酶NheⅠ、NotⅠ對合成的Klotho基因及載體質粒pDC316- mCMV- EGFP進行雙酶切鑒定。雙酶切反應質粒體系包含NheⅠ1 μL、NotⅠ1 μL、pDC316- mCMV- EGFP質粒1 μg、緩沖液2 μL、牛血清蛋白(BSA)2 μL、ddH2O補足至20 μL，37 ℃孵育2 h。目的基因體系包括：Klotho PCR產物14 μL、緩沖液2 μL、BSA 2 μL、NheⅠ 1 μL、NotⅠ 1 μL，37 ℃孵育2 h。使用DNA凝膠提取試劑盒根據說明書操作進行回收，分別獲得目的基因酶切產物和酶切質粒大片段。經純化后，在22 ℃環境下，經T4 DNA連接酶作用將載體片段與目的基因片段連接，連接反應體系包含目的基因6 μL、T4 DNA連接酶1 μL、質粒大片段2 μL、10×DNA連接酶Buffer 1 μL，反應體系總共為10 μL，在22 ℃連接2 h。采用熱休克法將10 μL上述連接產物與100 μL JM109感受態細胞進行轉化培養，次日挑取LB平板上氨芐西林抗性的5個單克隆菌落并接種至10 mL培養基擴增，隨后37 ℃搖床震蕩培養20 h，根據去內毒素小量質粒抽提試劑盒說明書取3 mL菌液抽提質粒，經NheⅠ和NotⅠ雙酶切鑒定和基因測序驗證。需同時構建空白質粒pDC316- mCMV- EGFP作為對照。

1.2.3重組腺病毒載體Ad- EGFP- Klotho的包裝 根據Polyfectin脂質體使用說明書，將鑒定正確的穿梭質粒pDC316- mCMV- EGFP- Klotho、骨架質粒采用脂質體介導的方法共同轉染入HEK293細胞，進行細胞內同源重組，大量擴增，在高速離心機上以最大速率離心去除細胞碎片，收集上清液，得到重組腺病毒Ad- EGFP和Ad- EGFP- Klotho。隨后行PCR鑒定：取2 μL腺病毒，加2 μL胰蛋白酶K，56 ℃溫育，沸水10 min后立即冰浴，在高速離心機上以最大速率短暫離心后取1 μL作為模板，加入特異性引物、dNTP 混合物及無核酸水進行PCR擴增。擴增反應條件為：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，40個循環；72 ℃終末延伸15 min，所獲PCR產物行電泳。

1.2.4重組腺病毒質粒Ad- EGFP- Klotho的擴增及純化 將感染復數(MOI)=1的重組腺病毒載體Ad- EGFP- Klotho病毒液感染5×108個HEK293細胞，并置于37 ℃，5% CO2培養箱中擴增，隨后每天觀察細胞病變效應(cytopathic effect,CPE)[5]，當出現完全CPE時即可收獲細胞，-80 ℃/37 ℃反復凍融4次，隨后4 ℃下高速離心5 min裂解細胞，離心并收集病毒上清液，根據腺病毒純化試劑盒使用說明書純化病毒。

1.2.5重組腺病毒Ad- EGFP- Klotho轉染HEK293細胞情況 將HEK293細胞按2×105接種于6孔板中，設置MOI=100，在轉染前2～4 h加入不含血清的DMEM培養基500 μL，輕微混勻后置37 ℃，5% CO2培養箱孵育，期間每15分鐘震蕩培養基1次，2 h后去除培養基，加入2 mL含10% FBS的DMEM新鮮培養基，48 h后置于熒光顯微鏡下，觀察細胞表達EGFP的情況。

1.2.6重組腺病毒Ad- EGFP- Klotho的病毒滴度測定 為減少病毒損耗，應盡量避免反復凍融，采用10倍梯度倍比稀釋法在96孔板中計算病毒滴度。經48 h感染，置于熒光顯微鏡下，計數熒光細胞情況。高稀梯度m的孔若數出N(N<10)個帶熒光的細胞，則病毒滴度為N×10m/mL(m為稀釋梯度)，若N>10，則需繼續稀釋，如果觀察不清楚可先換PBS再進行觀察，計數方法同前。采用計算公式[5]：半數組織細胞感染量(TCID50)=101+d(s-0.5)，再根據公式T=a×10bTC，ID50(單位mL)=10b-0.7PFU/mL進行換算。其中，T為1為最高稀釋度的對數，d為稀釋系數，s為陽性比率總和，a為陽性比率，b為滴度對數值，TC為組織細胞培養物，ID50為半數感染量。

2 結 果

2.1重組穿梭質粒pDC316- mCMV- EGFP- Klotho的鑒定 重組穿梭質粒經NheⅠ和NotⅠ雙酶切鑒定后發現，在3 045 bp處可見到目的基因Klotho片段，在6.7 kb處可見到穿梭質粒pDC316- mCMV片段(圖 1)，與預期一致。從Ad- EGFP- Klotho重組腺病毒樣品中可以檢測到3 045 bp的條帶，表明目的基因已成功整合在病毒基因組中(圖2)。經基因測序顯示，Klotho基因片段與原始序列比對相符。

1、2：pDC316- MCMV- EGFP- KlothoNheⅠ+ NotⅠ雙酶切鑒定結果；M:DNA分子標記物

圖1重組穿梭質粒pDC316-CMV-EGFP-Klotho酶切鑒定結果

2.2重組腺病毒Ad- EGFP- Klotho的鑒定 重組腺病毒Ad- EGFP- Klotho轉染HEK293細胞，轉染8 d后細胞表現出CPE現象，置于熒光顯微鏡下觀察，可見大量表達EGFP,見圖3。

M:DNA分子標記物；1：Ad- EGFP- Klotho病毒原液；2：Ad- EGFP- Klotho病毒10倍稀釋液

圖2重組腺病毒Ad-EGFP-KlothoPCR鑒定結果

A：HEK293細胞轉染后24 h，細胞仍貼壁生長，未見變大、變圓等現象，并可見EGFP表達;B:HEK293細胞轉染8 d后，可見HEK293細胞出現CPE現象并大量擴增，EGFP廣泛表達

圖3Klotho和EGFP轉染后到獲得重組腺病毒的EGFP表達圖

2.3重組腺病毒Ad- EGFP- Klotho感染HEK293細胞的效率 當MOI=100時，重組腺病毒Ad- EGFP- Klotho轉染HEK293細胞24 h后，細胞生長情況良好，無污染，熒光顯微鏡下可見滿視野HEK293細胞表達EGFP，感染效率達91.75%，見圖4。

A：轉染24 h；B:轉染60 h

圖4重組腺病毒Ad-EGFP-Klotho感染HEK293細胞擴增病毒效率圖

2.4重組腺病毒Ad- EGFP- Klotho的滴度測定 經反復感染、擴增、包裝、純化及濃縮，可獲得高滴度重組腺病毒Ad- EGFP- Klotho。測定病毒滴度為2.0×1010Tu/mL，高于對照組(Ad- EGFP)的滴度，滿足后續實驗要求。

3 討 論

Klotho基因位于染色體13q12區域[6- 7]，由5個外顯子和4個內含子組成，全長大約50 kb。人、小鼠和大鼠的外顯子長度分別為3 022、3 036、3 042 bp，且以上三者Klotho基因之間存在同源性(人和小鼠80%，人和大鼠83%)，第三外顯子區域存在一個固有的供體剪切位點，可進行選擇性剪切。根據選擇性剪切后，轉錄兩種產物：跨膜型和分泌型Klotho蛋白。研究顯示，跨膜型Klotho蛋白相對分子質量為130×103，全長編碼1 014個氨基酸，該蛋白包含1個N- 末端信號序列，1個單跨膜螺旋區域，1個短胞內區域和1個胞外區域[8]。單跨膜螺旋區域貼近C- 末端，胞外區域又分為2個固有的重復序列KL1和KL2，中間又存在1個短的延伸基礎氨基酸序列(賴氨酸- 賴氨酸- 精氨酸- 賴氨酸)。研究還表明，血液中分泌的Klotho蛋白可作為調節各種靶器官的激素，對心血管系統有保護作用[9- 12]。Klotho蛋白對血管內皮細胞具有抗氧化應激，抗炎和抗細胞凋亡作用。

本研究采用病毒載體系統將目的基因導入靶細胞。研究顯示，導入系統不依賴于宿主細胞基因組整合的基因遞送載體[13]，為基因轉導提供了若干優點，主要是避免插入誘變和位置效應異常。然而，除非設計用于復制和分離，否則非整合載體將在增殖細胞中逐漸稀釋，并且不能免除表觀遺傳效應。這些用于編輯細胞基因組的方法還允許將表達盒靶向整合到“安全港”，例如19號染色體上的AAVS1位點或內源基因座。為了實現這點，表達盒必須側接核酸酶切位點周圍的DNA以指導同源修復并且還可以有效遞送，例如用非整合的慢病毒載體[14]。目前，腺病毒載體作為廣泛使用的病毒載體之一，血清5型腺病毒運用最廣，它具有安全性高、免疫原性低、感染效率高、宿主廣泛、能介導基因的長期穩定表達、所制備的病毒滴度高、高效轉導目的基因、物理性質穩定、不整合入宿主細胞基因組、致病性低的優點，且具有分別轉染靜息期及分裂期細胞，對各種細胞和組織親嗜性差異等特點[15]。因此，腺病毒載體可以廣泛應用于各領域基因治療，故本研究根據其特點選用5型腺病毒作為載體進行目的基因重組。

本研究使用的AdMaxTM腺病毒載體系統在HEK293細胞中，經Cre酶催化，產生的催化效率較前大大提高。ST GEORGE等[16]對腺病毒載體的研究結果顯示：目的基因不超過8 kb，幾乎全部重組腺病毒都能夠有效攜帶，并在細胞中穩定表達、產率高。除此之外，與其他啟動子相比，本研究所使用的mCMV啟動子作用更強，目的基因能夠高水平表達，并且所構建的穿梭質粒中攜帶EGFP基因，能夠在熒光顯微鏡下直觀評估重組腺病毒轉染HEK293情況和感染細胞擴增效率情況。

本研究證明，已獲得2×1010Tu/mL的高滴度重組腺病毒載體Ad- EGFP- Klotho，該重組腺病毒載體含有目的基因Klotho，可高表達EGFP，能夠滿足后續研究，甚至為臨床研究提供了研究依據。