LncRNA ATB/miR- 107/STAMBPL1軸調控前列腺癌增殖、轉移和侵襲的作用機制*

滕若冰,余 鵬，高 漓

(桂林醫學院附屬醫院：1.生殖醫學中心；2.泌尿外科，廣西桂林 541000)

前列腺癌是男性最常見的惡性腫瘤，在男性惡性腫瘤中發病率排名第2位，占癌癥相關死亡的13%[1]。近年來，前列腺癌發病率和病死率呈持續增長趨勢且高年齡患者比重明顯上升[2- 3]。早期篩查診斷和手術切除是目前治療早期前列腺癌的主要方法[4- 5]。由于前列腺癌發病隱匿、容易早期轉移，患者就診時多處于癌癥晚期，體內出現局部浸潤及遠處轉移，失去手術根治的機會[6]。長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一類轉錄長度超過200 nt的非編碼RNA，其可在翻譯、翻譯后修飾水平調控基因的表達，例如DNA甲基化、基因沉默、組蛋白修飾等，從而發揮生物學作用[7]。因此，本研究以轉化生長因子β活化的lncRNA(lncRNA ATB)作為研究對象，探討lncRNA ATB在前列腺癌組織中的表達及其對前列腺癌PC3細胞增殖、遷移及侵襲的影響，為前列腺癌的發病機制研究提供重要的理論依據和新的思路，現報道如下。

1 材料與方法

1.1細胞與試劑 前列腺癌PC3細胞株購自中國科學院上海細胞庫；DMEM培養基和胎牛血清購自美國Gibco公司；Trizol、Lipofectamine 2000試劑購自美國Invitrogen公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)檢測試劑盒購自美國Sigma公司；PCR試劑盒購自日本Takara公司；Transwell小室和Matrigel基質膠購自美國Millipore公司；STAM結合蛋白樣1(STAMBPL1)抗體、DAPDH抗體購自德國Santa Cruz公司。

1.2方法

1.2.1病例標本收集 收集58例2016年1月至2018年10月于本院接受手術的58例前列腺癌患者病理組織及相應癌旁正常組織。術中組織液氮凍存后放入-80 ℃超低溫冰箱中存用。本研究中所有方案獲得了本院倫理委員會同意并獲得批準，患者在術前均簽署了相關知情同意書。

1.2.2細胞培養及轉染 將狀態良好的前列腺癌PC3細胞株在含10%胎牛血清的DMEM培養基中培養，條件為37 ℃、5% CO2及100%飽和濕度。待細胞匯合至70%～80%時進行傳代培養。細胞培養于6孔板中，采用無血清的培養基同步化24 h，將細胞分為si- NC組與si- ATB組，按照Lipofectamine 2000轉染試劑盒說明，分別轉染空白質粒和ATB干擾質粒。

1.2.3反轉錄PCR(RT- PCR)檢測ATB和miR- 107的表達 采用Trizol法提取組織中總RNA，按照反轉錄試劑盒說明書進行操作。實時定量PCR運用SYBR Premix Ex TaqlⅢ試劑盒，儀器使用ABI prism 7300。相應引物序列，IncRNA ATB正向引物為5′- TCC GCT TAT TGG TCT ATC GAT- 3′，反向引物為5′- TTC GAT TGG CAC CTA ATT TAC TCG- 3′;GAPDH正向引物為5′- CGA GTC ACA GGT CGC ATA CC- 3′,反向引物為5′- CGA TTC TTA TAA CTT CTA GT- 3′；miR- 107正向引物為5′- AGT TAA CCT CAA GTC GCC TCT A- 3′，反向引物為5′- ATT CAC GGG CTT TAC GCA- 3′。采用2- ΔΔCt法計算ATB和miR- 107的相對表達水平。

1.2.4MTT實驗測定細胞增殖水平的變化 將兩組對數生長期PC3細胞用胰蛋白酶消化，配制成細胞懸液，細胞在37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h后接種于96孔板中，每孔加入MTT溶液20 μL繼續培養4 h。孵育后加入二甲基亞砜(DMSO)振蕩溶解，采用自動酶標儀在490 nm波長下讀取光密度(OD)值，計算細胞存活率。

1.2.5Transwell實驗檢測細胞侵襲能力 取兩組對數生長期的PC3細胞用胰酶消化后用無血清DMEM培養基調整細胞濃度至2×106個/mL，將細胞液50 μL加入Transuell小室上室，將Transwell小室置入含500 μL 10%胎牛血清的DMEM培養基的24孔培養板,在37 ℃、5% CO2條件下培養24 h后觀察膜及孔下細胞數。0.5%結晶紫溶液染色20 min，染色結束后洗脫殘余結晶紫溶液，用棉簽擦去基質膠和小室內的細胞進行拍照、計數和統計學分析。

1.2.6細胞劃痕實驗 取兩組對數生長期的PC3細胞置于6孔板中，細胞密度約為8×105個/孔。每組設3個復孔，用100 μL槍頭沿直尺垂直于培養板背后的橫線劃線，注意槍頭保持垂直不要偏斜。劃線結束后采用不含血清培養基洗2～3次，于培養0 h和24 h在鏡下拍照并測量劃痕寬度。

1.2.7Western blot實驗檢測STAMBPL1蛋白表達 加入含1%苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解液，混勻后裂解30 min，提取si- NC與si- ATB組兩組細胞蛋白。BCA試劑盒檢測蛋白濃度，十二烷基硫酸鈉- 聚丙烯酰胺凝膠(SDS- PAGE)電泳后將蛋白電轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，加入STAMBPL1和GAPDH抗體后在4 ℃溫度下孵育過夜。采用羊抗鼠的二抗(1∶1 000稀釋)孵育50 min，TBST液洗滌3次，滴加超敏ECL化學發光底物顯影曝光。

2 結 果

2.1lncRNA ATB在前列腺癌組織及癌旁正常組織中的表達 RT- PCR結果顯示，58例前列腺癌組織及癌旁正常組織中,前列腺癌組織中ATB mRNA表達水平顯著增加，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

A：MTT實驗；B:細胞劃痕實驗；C:Transwell實驗；a:P<0.05，與si- NC組比較

圖2沉默lncRNAATB對前列腺癌PC3細胞增殖、遷移及侵襲水平的影響

A：miR- 107 RT- PCR結果分析圖；B:STAMBPL1 Western blot及其結果分析圖；a:P<0.05，與si- NC組比較

圖3沉默lncRNAATB對前列腺癌PC3細胞中miR-107/STAMBPL1信號通路的影響

2.2前列腺癌組織中lncRNA ATB的表達水平與前列腺癌患者臨床病理特征的相關性 分析lncRNA ATB的表達水平與臨床病理特征的相關性，結果提示：lncRNA ATB的表達與術前前列腺特異性抗原(PSA)水平、臨床分期、Gleason評分及是否轉移密切相關(P<0.05),見表1。

2.3沉默lncRNA ATB對前列腺癌PC3細胞增殖、遷移及侵襲能力的影響 實驗結果顯示，與si- NC組相比，si- ATB組前列腺癌PC3細胞增殖、遷移及侵襲能力明顯減低，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

2.4沉默lncRNA ATB對前列腺癌PC3細胞中miR- 107/STAMBPL1信號通路的影響 采用RT- PCR實驗檢測沉默lncRNA ATB對前列腺癌PC3細胞中miR- 107的表達變化。結果顯示，與si- NC組比較，si- ATB組中miR- 107 mRNA表達水平明顯增加,差異有統計學意義(P<0.05)；采用Western blot實驗檢測沉默lncRNA ATB對前列腺癌PC3細胞中STAMBPL1蛋白水平的影響。結果顯示，與si- NC組相比，si- ATB組STAMBPL1蛋白表達水平明顯減少,差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3。

表1 lncRNA ATB表達水平與前列腺癌患者臨床病理 特征的相關性(n)

續表1 lncRNA ATB表達水平與前列腺癌患者臨床病理 特征的相關性(n)

3 討 論

目前研究已證實，人類基因組中僅1%～2%具有蛋白編碼功能，其余均為非編碼序列[8]。其中，lncRNA多位于細胞核或細胞質內，主要由RNA聚合酶Ⅱ轉錄生成，可調控染色質重塑、并對轉錄和轉錄后基因進行調控[9- 10]。近年研究已證實，腫瘤細胞內某些特定lncRNA的異常表達與腫瘤的發生、發展密切相關。許多lncRNA在前列腺癌中表達發生變化，具有診斷與作為治療靶點的潛力，如lncRNA MALAT1可通過靶向miR- 320b產生作用，從而促進前列腺癌細胞增殖和周期進程，其作用機制可能與AR信號通路激活有關[11]；lncRNA Meg3在前列腺癌中呈低表達，通過Meg3/miR- 9- 5p/QKI- 5軸影響前列腺癌細胞增殖、遷移、侵襲能力及細胞凋亡[12]；lncRNA NAP1L6在前列腺癌的發生、發展中發揮作用，可能是影響前列腺癌患者臨床預后的重要因素[13]。

ATB是位于人第14號染色體，長度約80 kb的長鏈非編碼RNA。ATB由轉化生長因子β(transforming growth factor β)激活，而后者在調控腫瘤細胞上皮間質轉化(epithelial- mesenchymaltransition，EMT)過程中具有重要作用[14]。文獻發現ATB可作為內源性競爭RNA(ceRNA)競爭結合miR- 200c，并解除miR- 200c對其靶基因Twist1的抑制，且通過ATB/miR- 200c/Twist1軸在乳腺癌中影響細胞EMT的進程[15]；此外，ZHAI等[16]研究發現ATB在膀胱癌中表達顯著增加，通過抑制miR- 126的表達進一步促進膀胱癌的增殖、遷移和侵襲，這些發現可為膀胱癌提供潛在的預后生物標記物和治療靶點。本研究首先對前列腺癌組織及癌旁正常組織中ATB的表達水平進行了檢測，發現前列腺癌患者組織中ATB表達明顯高于癌旁正常組織。接下來，本研究分析了前列腺癌組織中ATB的表達水平與患者臨床病理特征的相關性，結果提示ATB與腫瘤的術前PSA水平、臨床分期、Gleason評分及是否轉移密切相關。此外，在PC3細胞中沉默ATB后，細胞增殖、遷移及侵襲能力明顯降低，提示ATB參與了前列腺癌的發生、發展過程，在前列腺癌中可能扮演了“促癌基因”的角色。

STAMBPL1是JAMM家族成員的主要因子，已有相關研究表明STAMBPL1與腫瘤的發生、發展密切相關[17]。LEE等[18]發現STAMBPL1基因在淋巴癌細胞系中上調，其機制與病毒復制密切相關；LI等[19]研究顯示，在子宮頸癌的HeLa細胞中，STAMBPL1的甲基化可通過 NF- κB 、TGF- β和PI3K信號通路途徑導致細胞增殖和發揮抗凋亡的作用。miR- 107可通過多種信號轉導途徑調控腫瘤的發生、發展過程。研究表明，miR- 107在胃癌和乳腺癌中可分別靶向BDNF和HMGA1基因的表達，從而發揮抑制腫瘤的作用[20]。在本研究中，沉默ATB后前列腺癌PC3細胞中miR- 107表達上調，STAMBPL1表達顯著降低。因此，作者推測沉默ATB表達抑制了前列腺癌細胞的侵襲、轉移，其機制可能與調控miR- 107/STAMBPL1信號途徑有一定關聯。

綜上所述，lncRNA ATB的異常表達可能與前列腺癌的發生、發展密切相關，可能是通過調控STAMBPL1的表達影響前列腺癌PC3細胞增殖、轉移和侵襲的能力。本研究了解了ATB在調節前列腺癌進展中的功能和分子機制，將為前列腺癌發病機制的闡明提供一定的理論基礎和新的思路。