貴陽部分醫院產ESBLs肺炎克雷伯菌分子流行病學及相關耐藥基因研究*

熊現秋,黃進友,侯 麗,陳秀英,應佳佳,閔少菊△

(1.貴州醫科大學附屬醫院檢驗組，貴州貴陽 550001；2.貴州醫科大學附屬白云醫院檢驗科，貴州貴陽 550001)

肺炎克雷伯菌是醫源性感染的常見致病革蘭陰性菌[1]。現在由于β-內酰胺類的抗菌藥物大規模使用，使得耐藥菌株的出現越來越多，其中主要的是產超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)的肺炎克雷伯菌[2-4]。在全球重要的醫源性感染耐藥中產ESBLs肺炎克雷伯菌引起的耐藥成為了當前重要問題，給臨床的治療和預防造成了很大阻力[5]。為了探討貴陽地區肺炎克雷伯菌耐藥性，指導臨床合理用藥，本研究收集了貴陽部分醫院2015年4月至2018年7月樣本培養所得的產ESBLs肺炎克雷伯菌118株進行分析，將研究結果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2015年4月至2018年7月貴州醫科大學附屬醫院、貴州省腫瘤醫院、貴州醫科大學附屬白云醫院成年住院患者產ESBLs肺炎克雷伯100株，產ESBLs肺炎克雷伯的診斷標準參照臨床實驗室標準化(CLSI)M100S標準執行。陽性對照選擇ATCC700603肺炎克雷伯菌，陰性對照選擇ATCC 25922肺炎克雷伯菌。

1.2儀器與試劑 用法國生物梅里埃VITEK2-compact細菌鑒定儀及配套卡片作細菌鑒定。M-H瓊脂糖培養基購自法國法國生物梅里埃公司，藥敏實驗采用經典紙片擴散法(K-B法)。整個實驗過程完全按照操作規程執行。

1.3耐藥基因檢測 引物由上海生物工程技術服務有限公司合成。PCR反應體系為50 μL：0.25 μL TaqExDNA聚合酶、5 μL 的10×PCR Buffer、4 μL 的dNTP混合物、2 μL的質粒DNA模板、3 μL相應引物見表1，各15 pmol/L、32.75 μL的無菌去離子水。TaqExDNA聚合酶、PCR Buffer、dNTP由購 自 TaKaRa公司。擴增條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃解鏈25 s。64 ℃退火30 s，75 ℃延伸30 s，進行30個循環擴增。PCR擴增儀為Bio-Rad公司產品。測序法(IlluminaHiSeq 2000,上海寶騰生物技術有限公司完成)對部分陽性產物進行測序，結果與基因庫頒布的序列進行比較。

表1 PCR擴增引物序列及長度

2 結 果

2.1藥敏試驗結果 氨芐西林在22種抗菌藥物中耐藥性比例最高，其次為哌拉西林和頭孢唑啉，比例分別為95.2%、64.7%和63.3%；耐藥率最低的是碳青霉烯類抗菌藥物，美羅培南和亞胺培南分別為2.9%和4.0%。見表2。

2.2產ESBLs肺炎克雷伯菌的耐藥性 產ESBLs的肺炎克雷伯菌在118株中有52株，比例為44.1%。除亞胺培南與美羅培南外，產ESBLs株對其余20種抗菌藥物的耐藥率均大于95%。

2.3耐藥基因檢測結果 118株菌中有6株未擴增出ESBLs基因型，其余均擴增出了相應的基因。僅攜帶1種基因型的分別為TEM型3株(2.5%)，SHV型5株(4.2%)，CTX-M型33株(28.0%)，KPC型6株(5.1%)。其中52.5%的菌株同時攜帶兩種以上ESBLs基因型，10.1%的菌株同時攜帶3種以上基因型，且多為TEM型與CTX-M型或與SHV型基因共同存在。擴增基因產物見表3。對118株檢出菌株檢出基因型進行統計分析，兩種基因同時檢出的比例前三位分別為：TEM+CTX-M(9.3%)；TEM+SHV(8.5%)；TEM+KPC(7.6%)。同時檢出3種基因的為：TEM+SHV+CTX-M(3.4%)；TEM+SHV+KPC(2.5%)；SHV+CTX-M+KPC(1.7%)。4種基因都檢測出的有3株，檢出率為2.5%。

表2 118株產ESBLs肺炎克雷伯菌對22種抗菌藥物的耐藥率(%)

表3 耐藥基因各基因型陽性菌株檢出比

2.4耐藥基因測序結果 本研究取12株TEM亞組陽性菌株進行測序，基因型均為TEM-1；取18株CTX-M亞組陽性菌株進行測序，結果基因型為9株CTX-M-15，5株CTX-M-14，4株為CTX-M-24；15株SHV陽性菌株的基因型分別為SHV-1、2、11、12、27、61、99；取11株KPC亞組陽性菌株進行測序，結果8株基因型為KPC1，3株基因型為KPC2。

3 討 論

細菌的耐藥早已成為全球性問題，并在世界范圍內流行。碳青霉烯類抗菌藥物可以有效治療肺炎克雷伯菌感染，但臨床不合理應用抗菌藥物使耐碳青霉烯類革蘭陰性桿菌數量逐年增加[6-9]。ESBLs水解β-內酰胺環，尤其是頭孢他啶、頭孢噻肟和氨曲南等廣譜抗菌藥物，產ESBLs目前是革蘭陰性菌耐藥的主要原因之一[10-13]。

本文124株肺炎克雷伯菌藥敏結果顯示，耐藥性較高的5種抗菌藥物依次為氨芐西林、哌拉西林、頭孢唑林和頭孢呋辛鈉。敏感率較高的5種抗菌藥物依次為亞胺培南、美羅培南、阿米卡星、慶大霉素和復方磺胺甲噁唑。本文中多重耐藥菌占實驗菌株的52.5%，可見肺炎克雷伯菌耐藥非常嚴重。本研究顯示，118株肺炎克雷伯菌有87株帶有CTX-M型ESBLs，說明本地區成人肺炎克雷伯菌中ESBLs基因大多數攜帶有CTX-M型。CTX-M 系列酶其主要特征是對頭孢噻肟水解能力較強，而對頭孢他啶的水解能力很弱。CTX-M-15型和CTX-M-14型、CTX-M-24型是本地區成人肺炎克雷伯菌產ESBLs的流行型，與其他國內報道有所不同。同時本文結果可以看出本院產ESBLs肺炎克雷伯菌多基因攜帶情況較常見，多為CTX-M型與TEM型或SHV型基因同時存在，由此推斷，產ESBLs肺炎克雷伯菌攜帶多種耐藥基因，是造成本院肺炎克雷伯菌多重耐藥的主要原因。ESBLs的產生很大程度上是由于β-內酰胺類抗菌藥物的濫用引起的[14-15]，ESBLs會使醫院感染變得復雜化，正確使用抗菌藥物有助于控制其播散與爆發流行,要控制產ESBLs細菌的流行，不能光靠治療，首先要做到正確合理的使用抗菌藥物。根據目前所有研究報道碳青霉烯類抗菌藥物(亞胺培南、美羅培南)ESBLs最有效，可作為首選藥物，本研究結果也證實了這一結論，因此可以指導產ESBLs肺炎克雷伯菌的精準用藥。作為醫護人員尤其是檢驗人員，應加強防范意識，嚴格執行消毒隔離制度，加強對細菌及耐藥的檢測，并隨時將耐藥動態通報臨床，指導臨床合理使用抗菌藥物，控制產ESBIS菌株的播散，以延緩細菌耐藥的產生，從而達到減少發病、降低發病率、減少耐藥菌傳播的目的[16]。

4 結 論

成人產ESBLs的肺炎克雷伯菌耐藥嚴重，本地區成人肺炎克雷伯菌中ESBLs基因大多數攜帶有CTX-M型，其中CTX-M-15型、CTX-M-14型、CTX-M-24型是本地區成人肺炎克雷伯菌產ESBLs的流行型。同時產ESBLs肺炎克雷伯菌多基因攜帶情況較常見，多為CTX-M型與TEM型或SHV型基因同時存在。