利用GeneXpert 法檢測耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌耐藥基因及耐藥性分析*

宋林鍵,葉麗艷,趙 強(qiáng),沈躍云,羅燕萍

(解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，北京 100853)

隨著抗菌藥物在臨床治療中的廣泛應(yīng)用，在抗菌藥物的選擇壓力下，細(xì)菌的耐藥能力逐漸增強(qiáng)，多藥耐藥菌的檢出率也逐年上升[1]。其中，耐碳青霉烯類抗菌藥物細(xì)菌的出現(xiàn)和傳播，引起了廣泛的關(guān)注。作為抗菌譜最廣，抗菌活性最強(qiáng)的第三線臨床抗感染藥物，碳青霉烯類抗菌藥物常用于治療產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶和頭孢菌素酶的腸桿菌科細(xì)菌所引起的感染。但近年來，耐碳青霉烯類抗菌藥物的腸桿菌科細(xì)菌(CRE)已經(jīng)出現(xiàn)并呈上升趨勢(shì)，其中以肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌最為嚴(yán)重，這給相關(guān)細(xì)菌感染的控制和治療帶來了諸多困難。因此，快速準(zhǔn)確地了解鑒定耐藥基因的類型，對(duì)臨床治療及預(yù)防耐藥菌的傳播具有重要的意義。

GeneXpert Carba-R?系統(tǒng)由美國Cepheid研發(fā)、生產(chǎn)的核酸提取擴(kuò)增檢測一體化系統(tǒng)，可在體外快速定性或定量檢測感染性疾病病原、耐藥性基因及腫瘤基因等，結(jié)果高度準(zhǔn)確，可及時(shí)為臨床決策提供診療依據(jù)[2]。已有研究結(jié)果表明賽沛 GeneXpert Carba-R?全自動(dòng)病原體快速檢測系統(tǒng)能快速準(zhǔn)確的檢測出耐碳青霉烯酶基因[3-5]。為快速鑒定耐碳青霉烯類抗菌藥物及其攜帶的耐藥基因，也為指導(dǎo)臨床醫(yī)生合理用藥提供早期依據(jù)，現(xiàn)將本院2016年3月至2017年 10月利用GeneXpert Carba-R?全自動(dòng)病原體快速檢測系統(tǒng)檢出的非呼吸道標(biāo)本中的CRE菌株的分布和耐藥基因特點(diǎn)分析結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集 2016年3 月至 2017年10月本院臨床患者的非呼吸道標(biāo)本(尿液、引流液、靜脈血、膽汁等)中分離出的亞胺培南耐藥的腸桿菌科菌株。同一患者，同一部位的標(biāo)本只收集1株。細(xì)菌分離鑒定按《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》要求執(zhí)行。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌 ATCC25922。

1.2儀器與試劑 全自動(dòng)快速微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)VITEK MS和VITEK 2 Compact型全自自動(dòng)微生物鑒定藥敏儀(法國生物梅里埃公司)，GeneXpert Carba-R?全自動(dòng)病原體快速檢測系統(tǒng)(美國賽沛公司)。

1.2.1菌株鑒定和藥敏試驗(yàn) 收集141株菌株，利用全自動(dòng)快速微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)VITEK MS進(jìn)行細(xì)菌鑒定。同時(shí)采用VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定和藥敏分析系統(tǒng)對(duì)分離菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，檢測其對(duì)阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦、氨曲南、頭孢他啶、亞胺培南、慶大霉素、復(fù)方磺胺甲噁唑的耐藥情況。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。

1.2.2細(xì)菌耐藥相關(guān)基因檢測 用含有Xpert Carba-R的試劑盒將菌株在Cepheid GeneXpert Ⅳ系統(tǒng)上進(jìn)行分析[4]。采用中國藍(lán)平板培養(yǎng)141株CRE細(xì)菌，挑取單個(gè)菌落，使用生理鹽水分別配置成0.5麥?zhǔn)蠞舛鹊木鷳乙海瑢?0 μL菌懸液加入GeneXpert Carba-R?樣本試劑中混勻，將混勻后的液體15 mL加入到試劑盒中，掃碼上機(jī)，采用全自動(dòng)病原體快速檢測系統(tǒng)，48 min后讀取結(jié)果。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的WHONET5.6軟件對(duì)菌株分布及藥敏結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1CRE分布情況

2.1.1標(biāo)本來源分布 141株CRE主要來源為尿液37株(26.2%)，引流液32株(22.7%)，靜脈血21株(14.9%)，導(dǎo)管17株(12%)，膽汁11株(7.8%)，傷口分泌物7株(5%)，組織7株(5%)，胸腔積液4株(2.8%)，其他標(biāo)本來源5株(3.5%)。

2.1.2菌種分布 肺炎克雷伯菌最多(114株)，占總數(shù)的81%，與文獻(xiàn)報(bào)道的耐藥菌株流行情況一致[5]。大腸埃希菌13株(9%)，陰溝腸桿菌8株(6%)，弗氏枸櫞酸桿菌3株(2%)，產(chǎn)氣腸桿菌2株(1%)，魏氏檸檬酸桿菌1株(1%)。

2.2CRE的耐藥基因分布 141株CRE中，使用Xpert Carba-R?的試劑盒，共檢測出blaKPC103株，檢出率為73%；blaNDM22株，檢出率為15.6%；blaOXA-484株，檢出率為2.8%；含兩種及兩種以上耐藥基因12株，檢出率為8.5%。菌株基因型詳細(xì)分布見表1。

表1 141株CRE耐藥基因分布情況(n)

2.3藥敏結(jié)果 141株CRE對(duì)除碳青霉烯類抗菌藥物以外的常見8種抗菌藥物的藥敏結(jié)果見表2。將113株含耐藥基因的肺炎克雷伯菌與28株含耐藥基因的其他腸桿菌科細(xì)菌耐藥率結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見表3。將攜帶耐藥基因blaKPC(103 株)、blaNDM(22 株)的藥敏結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見表4。

表2 141株CRE的藥敏結(jié)果(%，n)

表3 肺炎克雷伯菌與其他腸桿菌科細(xì)菌藥敏結(jié)果

表4 blaKPC、blaNDM感染的菌株藥敏結(jié)果耐藥對(duì)比

3 討 論

細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥機(jī)制主要包括產(chǎn)碳青霉烯酶、外膜蛋白的缺失或改變及主動(dòng)外排泵機(jī)制，其中以產(chǎn)碳青霉烯酶耐藥為主[7]。本試驗(yàn)中檢測的KPC酶屬于由質(zhì)粒介導(dǎo)的A類碳青霉烯酶；IMP、VIM及NDM酶屬于由質(zhì)粒介導(dǎo)的B類金屬酶。OXA48屬于D類苯唑西林酶[8]，其中KPC型最多[9]。

本院141株非呼吸道來源的標(biāo)本中分離出的CRE中，blaKPC基因的檢出率高達(dá)73%，廣泛存在于各標(biāo)本中，96%為肺炎克雷伯菌。與2013年中華醫(yī)療感染雜志的報(bào)道相符[10]。其次blaNDM基因檢出率為15.6%，多分布于尿液標(biāo)本，僅有兩株為肺炎克雷伯菌，其余20株均為其他腸桿菌科細(xì)菌，分別是大腸埃希菌、陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、弗氏枸櫞酸桿菌及魏氏枸櫞酸桿菌。這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[11]。blaOXA-48檢出率僅為2.8%，標(biāo)本來源于靜脈血、導(dǎo)管、分泌物。菌種來源于肺炎克雷伯桿菌、大腸埃希菌及陰溝腸桿菌。blaKPC基因和blaNDM基因先后從肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌中首次發(fā)現(xiàn)，后通過質(zhì)粒或移動(dòng)元件介導(dǎo)的基因的水平轉(zhuǎn)移廣泛流行于腸桿菌中，造成了碳青霉烯耐藥性的廣泛傳播。近年來，blaKPC基因和blaNDM基因在檢出率逐年上升。在英國、美國、哥倫比亞、比利時(shí)、中國、法國、日本、希臘、巴西、波蘭、阿根廷及意大利等國家是重度流行國家，這些現(xiàn)象或許與抗菌藥物的不合理使用及特定時(shí)間人口的遷徙有關(guān)。值得注意的是本研究中還出現(xiàn)了8株攜帶兩種碳青霉烯酶基因和1株攜帶上述3種碳青霉烯酶基因的肺炎克雷伯菌。混合基因型中以攜帶blaKPC和blaOXA-48基因?yàn)橹鳎一旌匣蛐椭饕獊碜苑窝卓死撞＿@種多種碳青霉烯酶基因共存的現(xiàn)象，更進(jìn)一步說明了在抗菌藥物選擇的壓力下，菌株存在多種耐藥基因共存。

141株CRE對(duì)亞胺培南、氨芐西林、頭孢唑林、厄他陪南、氨芐西林/舒巴坦全耐藥，其他抗菌藥物的耐藥率由高到低依次為頭孢他啶、氨曲南、頭孢吡肟、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、慶大霉素、阿米卡星、復(fù)方磺胺甲噁唑。其中慶大霉素、阿米卡星和復(fù)方磺胺甲噁唑的耐藥率較低。不同菌株類型及攜帶不同耐藥基因種類統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示攜帶耐藥基因的肺炎克雷伯菌與其他腸桿菌科細(xì)菌在氨曲南、環(huán)丙沙星、頭孢吡肟、左氧氟沙星這4種抗菌藥物耐藥率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這就說明在不明確菌株耐藥基因的條件下，以上4種抗菌藥物可能對(duì)治療除肺炎克雷伯菌以外的腸桿菌科細(xì)菌感染可能有效。攜帶blaKPC，blaNDM耐藥基因的菌株藥敏結(jié)果分析中顯示其在阿米卡星、氨曲南、環(huán)丙沙星、頭孢吡肟、復(fù)方磺胺甲噁唑這5種抗菌藥物耐藥率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。尤其攜帶blaNDM耐藥基因的菌株對(duì)阿米卡星的耐藥率僅為13.6%。研究結(jié)果顯示不同細(xì)菌種類，不同的耐藥基因?qū)咕幬锏哪退幥闆r不同。這就表明在含有耐藥基因的CRE中，用藥時(shí)要綜合考慮細(xì)菌種類及所含耐藥基因類型。

綜上所述，本研究利用GeneXpert Carba-R?全自動(dòng)病原體快速檢測系統(tǒng)檢測出blaNDM4例，混合耐藥基因blaKPC+blaNDM3例，blaKPC+blaOXA-487例，blaIMP+blaOXA-481例，blaKPC+blaNDM+blaOXA-481例。GeneXpert Carba-R?用時(shí)短，操作簡單，可在40 min內(nèi)快速檢測碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細(xì)菌的耐藥基因，及時(shí)準(zhǔn)確地將結(jié)果反饋給臨床，為指導(dǎo)臨床合理用藥及預(yù)防耐藥菌株的流行具有極其重要的意義，缺點(diǎn)在于試劑盒費(fèi)用較高。Carba-R試劑盒可以直接利用標(biāo)本進(jìn)行快速基因鑒定，不需要對(duì)標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)[12]。快速檢測技術(shù)為耐藥基因的檢測提供了更好的方法，并為及時(shí)實(shí)施感染防治措施作出了貢獻(xiàn)[13-14]。同時(shí)，本研究試驗(yàn)結(jié)果顯示：攜帶不同耐藥基因的腸桿菌科細(xì)菌其用藥應(yīng)有所不同。快速、準(zhǔn)確地檢測出耐藥基因不僅有利于掌控院內(nèi)耐藥基因流行趨勢(shì)；同時(shí)為醫(yī)生針對(duì)不同患者合理用藥提供依據(jù)。面對(duì)CRE威脅，醫(yī)療機(jī)構(gòu)應(yīng)了解患者CRE感染危險(xiǎn)因素，采取相應(yīng)的干預(yù)措施[15-16]，制定并落實(shí)防控CRE感染策略，保障醫(yī)療安全，做好醫(yī)院感染控制工作。

4 結(jié) 論

GeneXpert Carba-R?全自動(dòng)病原體快速檢測系統(tǒng)可快速實(shí)時(shí)監(jiān)測含不同耐藥基因的CRE分布趨勢(shì)和流行特點(diǎn)，可即時(shí)發(fā)現(xiàn)并預(yù)防耐藥基因的暴發(fā)流行，便于臨床醫(yī)生針對(duì)不同的耐藥基因表型進(jìn)行合理用藥。