長鏈非編碼RNA CTD-3162L10.1調(diào)節(jié)SEMA3B表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響

魏 峰,張 錦,張逸群,鄭 蓉

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院婦科，湖北十堰 442000)

卵巢癌是婦科常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌[1]。卵巢癌患者確診時(shí)多為晚期，且復(fù)發(fā)率很高，預(yù)后較差[2]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200個(gè)核苷酸的長鏈RNA，由RNA聚合酶Ⅱ參與合成[3]。近年的研究表明，lncRNA具有影響基因表達(dá)的功能，廣泛參與調(diào)控增殖、分化、侵襲等細(xì)胞形態(tài)和功能的改變。lncRNA與腫瘤特別是卵巢癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4]。CTD-3162L10.1是一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，其在卵巢癌中的作用機(jī)制尚不明確。本研究旨在檢測(cè)CTD-3162L10.1在卵巢癌組織和細(xì)胞株的表達(dá)，分析CTD-3162L10.1與卵巢癌發(fā)生的相關(guān)性，并通過高表達(dá)CTD-3162L10.1，觀察CTD-3162L10.1對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響及探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1組織標(biāo)本 23對(duì)卵巢癌組織及相應(yīng)癌旁組織(距癌灶邊緣>5 cm)取自2016-2018年于婦科行手術(shù)切除的卵巢癌患者，術(shù)后經(jīng)兩位以上病理醫(yī)生確診為卵巢癌。年齡43～71歲，平均(48.92±7.23)歲。所有卵巢癌患者術(shù)前均未接受放、化療或生物靶向治療。研究方案經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.1.2細(xì)胞株和主要試劑 人正常卵巢上皮細(xì)胞IOSE80和卵巢癌細(xì)胞株A2780、SKOV-3、HO-8910、OC3、OVCAR-3購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。LipofectamineTM2000、RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基和基質(zhì)膠購自美國Invitrogen公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；空載質(zhì)粒和表達(dá)CTD-3162L10.1的質(zhì)粒購自廣州銳博生物科技有限公司；實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)引物購自北京擎科生物科技有限公司；qPCR試劑盒購于日本TaKaRa公司；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)試劑盒和細(xì)胞裂解液NP40購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Transwell小室購自美國Corning公司；β-肌動(dòng)蛋白(β-Actin)、信號(hào)素3B(SEMA3B)、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白6(IGFBP-6)、蛋白激酶B(AKT)、磷酸化的蛋白激酶B(p-AKT)蛋白抗體購自美國Becton Dickinson公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 在37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中，OC3、OVCAR-3細(xì)胞株培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，A2780、SKOV-3、HO-8910、IOSE80細(xì)胞株培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。接種對(duì)數(shù)生長期的OVCAR-3細(xì)胞至6孔板，將細(xì)胞分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，分別轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒和表達(dá)CTD-3162L10.1的質(zhì)粒，以50 ng/mL的濃度進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染操作嚴(yán)格依據(jù)LipofectamineTM2000說明書。轉(zhuǎn)染12 h后棄去轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，添加新鮮培養(yǎng)基。

1.2.2qPCR檢測(cè)細(xì)胞中CTD-3162L10.1和SEMA3B mRNA的表達(dá) 采用TRIzol法提取組織和細(xì)胞總RNA，紫外分光光度法檢測(cè)RNA濃度和純度，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。依據(jù)qPCR說明書進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性5 s，60 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。qPCR引物見表1。CTD-3162L10.1和SEMA3B mRNA表達(dá)量檢測(cè)以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參。Ct值以2-ΔΔCt方法進(jìn)行計(jì)算，代表CTD-3162L10.1和SEMA3B mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3MTT法檢測(cè)兩組OVCAR-3細(xì)胞的增殖能力 將對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組OVCAR-3細(xì)胞以5×103個(gè)/孔接種于96孔板，分別于接種后第1、2、3、4、5天采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力。檢測(cè)時(shí)在每孔，加16 μL MTT試劑，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，棄上清后加200 μL二甲基亞砜，搖床振蕩20 min，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔在490 nm波長處的吸光度(A)值。檢測(cè)5次后，繪制生長曲線。

1.2.4Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩組OVCAR-3細(xì)胞的侵襲能力 在Transwell小室上室底部加50 μL 濃度為0.2 μg/μL 的基質(zhì)膠，在培養(yǎng)箱中孵育30 min，保證基質(zhì)膠凝固。將對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組OVCAR-3細(xì)胞消化、離心后，采用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個(gè)/mL。將OVCAR-3細(xì)胞以4×104個(gè)/孔接種于Transwell上室，在 Transwell下室加600 μL含血清RPMI-1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。次日，采用甲醛固定30 min,采用結(jié)晶紫染液染色30 min，流水沖去多余染液，采用棉簽擦去未穿過底膜的細(xì)胞。在倒置顯微鏡下，隨機(jī)選5個(gè)視野下，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)并取均值。

表1 qPCR引物序列

1.2.5蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)SEMA3B及下游蛋白表達(dá) 采用細(xì)胞裂解液NP40裂解對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組OVCAR-3細(xì)胞并提取總蛋白，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組分別以50 μg的蛋白上樣量行聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳2 h，硝酸纖維膜轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂牛奶在室溫下封閉2 h，一抗在4 ℃冰箱內(nèi)內(nèi)孵育12 h，二抗在室溫下孵育1 h，滴加增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液，顯影、拍照。

2 結(jié) 果

2.1卵巢癌組織和癌旁組織中CTD-3162L10.1表達(dá)量 采用qPCR測(cè)得卵巢癌組織和癌旁組織中CTD-3162L10.1的表達(dá)量分別為(1.05±0.35)和(7.28±1.67)，CTD-3162L10.1在卵巢癌組織中呈低表達(dá)(P<0.05)。

2.2卵巢癌細(xì)胞株和人健康卵巢上皮細(xì)胞CTD-3162L10.1表達(dá)量 與人健康卵巢上皮細(xì)胞IOSE80相比，卵巢癌細(xì)胞株A2780、SKOV-3、HO-8910、OC3、OVCAR-3中CTD-3162L10.1均呈低表達(dá)(P<0.05)，OVCAR-3細(xì)胞表達(dá)量最低(P<0.05)。

2.3CTD-3162L10.1轉(zhuǎn)染效率測(cè)定 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組OVCAR-3細(xì)胞中CTD-3162L10.1相對(duì)表達(dá)量分別為(1.00±0.03)和(6.91±0.58)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中CTD-3162L10.1的表達(dá)量增加。

2.4高表達(dá)CTD-3162L10.1對(duì)OVCAR-3細(xì)胞增殖能力的影響 MTT法結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組OVCAR-3細(xì)胞從3 d開始，增殖能力明顯降低(P<0.05)。見圖1。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

圖1CTD-3162L10.1對(duì)卵巢癌細(xì)胞OVCAR-3增殖的影響

2.5過表達(dá)CTD-3162L10.1對(duì)細(xì)胞侵襲影響 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組OVCAR-3細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)分別為(99.95±11.50)個(gè)和(47.65±10.62)個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染CTD-3162L10.1后的卵巢癌細(xì)胞侵襲能力明顯降低。

2.6CTD-3162L10.1對(duì)兩組細(xì)胞中SEMA3B mRNA表達(dá)的影響 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組OVCAR-3細(xì)胞中SEMA3B mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為(1.01±0.07)和(4.16±0.34)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中SEMA3B mRNA的表達(dá)顯著降低。

2.7過表達(dá)CTD-3162L10.1對(duì)SEMA3B蛋白及AKT通路蛋白表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染CTD-3162L10.1后，SEMA3B、IGFBP-6蛋白的表達(dá)量增加，AKT蛋白表達(dá)無明顯改變，p-AKT蛋白表達(dá)量降低。見圖2。

圖2 Western blot檢測(cè)CTD-3162L10.1下游蛋白的表達(dá)

3 討 論

卵巢癌具有易轉(zhuǎn)移和易復(fù)發(fā)的特點(diǎn)，患者5年生存率小于30%[5]。尋找潛在的分子標(biāo)志物及針對(duì)卵巢癌增殖和遷移分子機(jī)制的研究非常重要。lncRNA長久以來被認(rèn)為是基因轉(zhuǎn)錄過程的隨機(jī)產(chǎn)物，不具有調(diào)控細(xì)胞活動(dòng)的功能[6]。然而，最近的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA可通過調(diào)控靶基因的表達(dá)，在卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用[7-10]。有研究表明，SNHG3、CCAT1、TP73-AS1、EBIC等多種lncRNA 在卵巢癌中表達(dá)增加，作為癌基因促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞生長、浸潤和轉(zhuǎn)移，與卵巢癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)[11-14]。另有研究表明，TUBA4B等lncRNA在卵巢癌中表達(dá)降低，作為抑癌基因抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖和侵襲[15]。CTD-3162L10.1是一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，由2 304個(gè)核苷酸組成，CTD-3162L10.1在卵巢癌中的研究未見報(bào)道。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CTD-3162L10.1在卵巢癌組織和細(xì)胞株中均呈低表達(dá)，表明CTD-3162L10.1可能作為抑癌基因參與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展，CTD-3162L10.1可能具有分子診斷標(biāo)志物的潛力。MTT法和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，高表達(dá)CTD-3162L10.1可抑制卵巢癌OVCAR-3細(xì)胞的增殖能力和侵襲能力，CTD-3162L10.1在卵巢癌中發(fā)揮抑癌基因的作用。SEMA3B定位于染色體3p21.3，屬于信號(hào)素家族成員，是一種分泌型蛋白質(zhì)，由749個(gè)氨基酸構(gòu)成[16]。SEMA3B是一種腫瘤抑制基因，在多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[17]。SEMA3B可通過促進(jìn)IGFBP-6的表達(dá)，抑制AKT信號(hào)通路的磷酸化，發(fā)揮腫瘤抑制作用[16-18]。有研究表明，SEMA3B在卵巢癌中表達(dá)明顯降低[19]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OVCAR-3細(xì)胞高表達(dá)CTD-3162L10.1后，SEMA3B蛋白的表達(dá)增加，表明CTD-3162L10.1可直接或間接促進(jìn)SEMA3B蛋白的表達(dá)。SEMA3B蛋白表達(dá)增加后，IGFBP-6蛋白的表達(dá)增加，AKT信號(hào)通路的磷酸化程度降低。AKT信號(hào)通路的磷酸化程度可明顯促進(jìn)腫瘤的增殖和侵襲[20]。高表達(dá)CTD-3162L10.1通過上調(diào)SEMA3B基因的表達(dá)，抑制AKT信號(hào)通路的磷酸化，導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞增殖和侵襲能力降低。本研究的不足之處在于，CTD-3162L10.1調(diào)控SEMA3B的具體作用機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步的研究。

4 結(jié) 論

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)CTD-3162L10.1在卵巢癌組織和細(xì)胞株中均呈低表達(dá)，CTD-3162L10.1通過靶向SEMA3B干擾AKT信號(hào)通路的磷酸化，抑制卵巢癌的增殖和侵襲，表明CTD-3162L10.1在卵巢癌中作為抑癌基因發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，為卵巢癌的分子靶向治療提供了新的思路。