MALDI-TOF MS在泛耐藥肺炎克雷伯菌中的藥敏試驗的應用評價*

鄭光輝，趙劍北，李斯文，張國軍△

(1.首都醫科大學附屬北京天壇醫院檢驗科，北京 100070；2.北京市免疫試劑臨床工程技術研究中心，北京100070；3.首都醫科大學臨床檢驗診斷學系，北京 100070)

肺炎克雷伯菌是腸桿菌科常見的致病菌[1]，目前其耐藥形勢越來越嚴峻，對各類抗菌藥物耐藥率在逐年上升[1-2]。因此，及時、快速地進行肺炎克雷伯菌的藥敏試驗對指導臨床抗菌藥物的使用和控制院內耐藥菌株的播散均具有重要意義[3]。目前，臨床實驗室對肺炎克雷伯菌的耐藥性監測仍以紙片擴散法和微量肉湯稀釋法為主。由于其原理是基于微生物的代謝反應，雖能基本滿足臨床需求，但是傳統的藥敏試驗方法耗時較長，阻礙了臨床的精準用藥[4]。基質輔助激光解析電離飛行時間質譜 (MALDI-TOF MS)是近年來用于微生物鑒定的有效工具，因具有快速、簡便等優點使其在臨床微生物鑒定方面得到廣泛應用[3]，其在微生物耐藥性監測方面也有了一定的報道，利用MALDI-TOF MS進行藥敏試驗可以提前24 h完成藥敏試驗且花費較低[5]。因此，為解決肺炎克雷伯菌感染的耐藥時效性問題，彌補單一方法的片面性和傳統方法人工操作繁瑣、耗時長等不足，本實驗利用MALDI-TOF MS分別對比不同耐藥表型及基因型的肺炎克雷伯菌進行檢測，尋找具有特定耐藥基因的特征蛋白的指紋圖譜，以達到能夠快速對耐藥肺炎克雷伯菌進行藥敏實驗的目的，本研究針對臨床上最廣泛的基因型作為研究對象，對MALDI-TOF MS在肺炎克雷伯菌藥敏試驗的應用方面做出了探索性研究。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集2018年3-9月首都醫科大學附屬北京天壇醫院微生物實驗室臨床標本分離得到的肺炎克雷伯菌，其中包含不同耐藥機制的肺炎克雷伯菌17株及野生型肺炎克雷伯菌11株。

1.2儀器與試劑 VITEK MS (生物梅里埃公司,法國)、CO2孵育培養箱(熱電公司，美國)、Phoenix 9240全自動培養系統(碧迪公司，美國)，CapitalBio RTisochip-A恒溫擴增檢測儀(北京博奧生物有限公司，中國),VITEK MS靶板(生物梅里埃,法國)、VITEK-MS CHCA基質液(生物梅里埃,法國)、哥倫比亞血平皿(天津市金章科技發展有限公司，中國)、一次性接種環(科藩公司，意大利)、QIAGEN DNA Kit試劑盒(凱杰公司，德國)、恒溫擴增試劑(北京博奧生物有限公司，中國)。

1.3菌株培養和鑒定 將利用紙片法保存的菌種從-80 ℃冰箱中取出，倒入營養肉湯，置于35 ℃孵育培養箱中恒溫培養16～24 h后，轉種于哥倫比亞血平皿上，再于35 ℃孵育培養箱中恒溫培養16～24 h。采用SARAMIS RUO模式菌株進行鑒定，確認其為肺炎克雷伯菌。

1.4耐藥基因檢測 采用微流控芯片對細菌的耐藥基因進行檢測，此項技術基于環介導等溫擴增(LAMP)技術進行微生物耐藥基因的測定，具體操作方法為抽取100 μL腦脊液細菌培養陽性培養液，置于1.5 mL無菌離心管中，37 ℃、12 000 r/min離心5 min，棄去上清，提取細菌的核酸。吸取26 μL恒溫擴增試劑，加入準備好的200 μL離心管中，加入26 μL被檢核酸樣品，輕搖使其充分混合均勻，離心至管底。吸取50 μL上述配制好的核酸擴增反應體系，加入到芯片主通道中，待其充滿芯片主通道即停止加樣，用封口膜封閉出樣口。將加樣后的芯片固定在低速離心機上，以6 000 r/min離心30 s后取下。置于CapitalBio RTisochip-A恒溫擴增檢測儀上進行檢測。50 min后得到檢測結果。如果樣本測試沒有結果或產生一個錯誤，或測試后沒有殘留DNA，標本在初始測試24 h內重新測試。測試的基因型包括blaKPC,blaSHV,blaTEM,blaCTX-M-9,ompK35和aadA1[6]，其中，耐藥基因的序列采用芯片自身的引物序列完成。

1.5MALDI-TOF MS檢測方法建立 以CHCA基質液為基準，參數設置：掃描范圍200～2 000 m/z，激光打點次數100，激光強度32 A，以212.03和379.09 m/z為基峰建立方法；2 000～20 000 m/z范圍以SARAMIS RUO模式自帶鑒定參考方法為準。

1.6MALDI-TOF MS檢測 將全部的17株耐藥肺炎克雷伯菌及11株敏感菌使用一次性接種環分別涂于靶板上，同時以ATCC 8739大腸埃希菌為質控菌種，檢測點及質控點均加入飽和CHCA基質液1 μL，待靶板晾干后應用MALDI-TOF MS RUO模式對菌株200～2 000 m/z范圍進行檢測。重復上述步驟，對菌株2 000～20 000 m/z范圍進行檢測，將Shimadzu Biotech MALDI-MS軟件上得到的峰圖使用SARAMIS Premium軟件進行評分。重復上述檢測，直至SARAMIS Premium軟件對所有菌株的峰圖評分得到90%以上，收集得到的峰圖數據。

2 結 果

2.1肺炎克雷伯菌耐藥基因結果 17株耐藥肺炎克雷伯菌的基因型微流控芯片檢測示意圖見圖1，檢測基因型見表1。

2.2MALDI-TOF MS結果 使用Shimadzu Biotech MALDI-MS軟件分析11株敏感菌200～2 000、2 000～20 000 m/z的質譜峰圖，其中在200～2 000 m/z范圍共篩選出63個峰，2 000～20 000 m/z范圍共篩選出83個峰，合計共146個峰。以±0.05%為偏差范圍，在偏差范圍以內視為同一峰，依次分析每株耐藥菌的質譜峰圖，棄去同一離子峰，只記錄不同離子峰。記錄完成后將敏感菌與耐藥菌進行對比，在200～2 000及2 000～20 000 m/z范圍區間內篩選出耐藥菌具有的離子峰，同時在敏感菌中不存在的峰，采用靈敏度進行表征，計算方式：靈敏度=耐藥株具有某離子峰數目/耐藥菌的總數目，結果顯示，在524 m/z，728 m/z的區分靈敏度最高，均達到76.47%。將耐藥菌根據不同基因型進行分組比對，篩選出blaKPC基因型、blaCTX-M-9基因型及其他基因型可能存在的特異峰，采用靈敏度與特異度表征，其中靈敏度=具備某基因型且具有某離子峰數目/具有某耐藥基因的總數目，特異度=不具備某基因且不具備某離子峰數目/不具備某耐藥基因的總數目)，見表2。

表1 耐藥肺炎克雷伯菌基因型

注：-表示未檢測出該基因

圖1 肺炎克雷伯菌的基因型微流控芯片檢測

表2 不同耐藥基因型的特異峰

續表2 不同耐藥基因型的特異峰

3 討 論

肺炎克雷伯菌是臨床腸桿菌科細菌重癥感染的重要細菌之一[7]，由于近年來肺炎克雷伯菌的耐藥率逐年增加，從而導致臨床治療遇到困難。耐藥基因的檢測可以解決時間長的問題，且可以實施精準用藥，目前檢測肺炎克雷伯菌耐藥基因的方法主要以多重PCR為主，操作較為繁瑣且假陽性率高，在臨床微生物實驗室開展難度較大[8]。MALDI-TOF MS目前在臨床微生物實驗室已經成為病原菌鑒定的常規方法，具有快速、簡便等特點。通過SARAMIS Premium軟件中質量圖譜與自帶數據庫的比對，可獲得細菌的種屬信息，分別對比具有不同耐藥基因的微生物質譜數據，可以獲取具有特定耐藥基因的特定蛋白峰，進而提供藥敏數據[9]。

本研究對比blaKPC基因型與無blaKPC基因型的菌株，分析發現4 518 m/z的峰可能作為blaKPC基因型對應的特異峰，其靈敏度可達到75.00%(8/12)，且在非blaKPC基因型的耐藥菌中均未發現此峰，因此認為此峰可能與肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥關系密切。有研究報道[3]，通過肉眼觀察特異峰4 521 m/z存在與否對ST11型產blaKPC肺炎克雷伯菌進行鑒別的特異度為95.20%，靈敏度為96.90%。由于可能存在校準差異與峰形位移等，可以將4 521 m/z與本實驗中得到4 518 m/z視為同一個峰。但由于本實驗沒有針對blaKPC基因型進行進一步分型，因此4 518 m/z特異峰的靈敏度只達到75%。即便如此，此峰在臨床快速鑒定產碳青霉烯酶型肺炎克雷伯菌仍有巨大應用潛力。

對比blaCTX-M-9基因型與無blaKPC基因型的肺炎克雷伯菌，其中4 518 m/z的靈敏度為80.00%(8/10)，特異度為85.70%(6/7)，其靈敏度與特異度相較其他特異峰均較好，但通過耐藥基因檢測結果發現，具有blaCTX-M-9基因型及具有blaKPC基因型的菌株高度重合，因此認為4 518 m/z應與blaKPC基因關聯更密切而與blaCTX-M-9基因型關系不大。同時，6 152 m/z特異峰的靈敏度為70%(7/10)，特異度為71.43%(5/7)，其可能與blaCTX-M-9基因型存在一定關聯。但唯一1株只具有blaCTX-M-9但不具有blaKPC基因的121號肺炎克雷伯菌不具有6 152 m/z特異峰，因此其與blaCTX-M-9基因的關聯無法確定。因此需增加樣本量對其進行檢測，才能進一步探討兩者間的關系。同時，將具有blaTEM基因型與無blaTEM基因型的菌株進行對比，7 430 m/z的特異峰雖然靈敏度高達90.91%，但特異度只有50.00%，因此認為其可能與肺炎克雷伯菌存在耐藥本身有關。

從基因測序結果來看，只有135號肺炎克雷伯菌的基因中不存在blaSHV和ompK35，其余全部菌株中均存在這兩個基因型，導致這兩種基因型的陰性株過少。因此，即使在此基因型的對比分析中存在靈敏度高達81.25%的728 m/z的峰，也不能排除是否是由于個體差異或者是隨機誤差導致的。且即使特異峰的結果具有一定意義，也無法確定其與blaSHV或ompK35基因型其中哪一種基因型有關，或是兩種基因型共同作用的結果[10-11]。因此此特異峰在本實驗中不具有臨床意義。在今后的研究中仍需對這兩個基因型進行進一步研究。

有報道稱，日本學者發現產blaKPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的特異峰11 109 m/z，該特異峰的本質為PKPQIL-p019蛋白，編碼該蛋白的基因與blaKPC毗鄰位于PKPQIL型質粒的Tn4401轉座子內[12]。然而該質粒僅僅在日本流行，在其他地區流行的不攜帶該質粒的產碳青霉烯酶型肺炎克雷伯菌無法檢測到該特異峰[13]。在本實驗中獲得的鑒定圖譜中亦未發現11 109 m/z的特異峰。據此推測，對于遺傳背景不同、同源性相差較大的菌株，其特異峰應也不盡相同，且其他基因型，其他耐藥機制的耐藥菌應都有一定地區差異性。因此，在此次試驗中檢測的北京天壇醫院的28株肺炎克雷伯菌，說明其可能在本地區流行病學中具有一定臨床意義。這也從側面說明了MALDI-TOF MS檢測在區域流行病學里對流行病病原菌的研究中擁有良好的應用前景。

本實驗一共納入了首都醫科大學附屬北京天壇醫院的耐藥菌17株，敏感菌11株，對其中存在的多種基因型均分別進行了比對，但實驗仍具有一定局限性：(1)樣本總量過少，某一基因型的耐藥菌及無某一基因型的耐藥菌株過少，結果可能在一定程度上反映了相對應的耐藥機制，但仍不可避免的具有一定不可控性。blaSHV和ompK35基因型由于陰性對照過少無法得出結論，其余基因型由于陽性標本數量過少而無法得出結論，因此在今后的研究中將進一步增加樣本量。(2)臨床難以得到單一基因型的耐藥肺炎克雷伯菌。復合耐藥基因之間可能存在相互干擾，轉錄產生的蛋白之間有可能會發生反應，從而產生新的特征峰，但由于缺乏單一耐藥基因的菌株，從而難以確定特征峰到底是由于幾種基因共同存在而產生的還是僅與其中某單一基因型有關。(3)MALDI-TOF MS方法無法定量檢測。某些基因型導致的耐藥可能是高表達和低表達的關系，并不是“有或無”，但由于MALDI-TOF MS的工作原理，峰的高低只是相較于參比峰的比值，并不是該細菌內此物質的絕對值多少，所以此類耐藥機制的基因型可能用此方法難以檢測。

綜上所述，通過本研究表明使用MALDI-TOF MS來快速鑒定肺炎克雷伯菌耐藥方式是實際可行的，且找到了如blaKPC與blaCTX-M-9的質譜相關蛋白。通過檢測耐藥肺炎克雷伯菌存在的特異峰來快速辨明其耐藥機制，具有快速、簡便、經濟且適用性強等優點，對指導臨床用藥和流行病學分析具有重要意義。

4 結 論

本研究顯示，利用MALDI-TOF MS對具有不同耐藥基因型的肺炎克雷伯菌進行耐藥性的預測具有一定的可行性，尤其是對于產碳青霉烯酶及ESBLs相關基因，靈敏度與特異度均維持在較高的水準，值得進行深入研究。