血漿游離DNA在非小細胞肺癌診斷中的價值分析

王健 董棟 渠敬明 李龍飛 周厚文 吳秀娟（通訊作者）

（1 徐州市腫瘤醫院腫防辦/胸外科 江蘇 徐州 221003 ）

（2 徐州醫科大學公共衛生學院 江蘇 徐州 221003）

肺癌為一種常見的惡性腫瘤，具有較高的病死率。肺癌結構中，85%屬于非小細胞肺癌（NSCLCA），且NSCLCA患者中，70%發現時已經處于晚期，喪失最佳治療機會[1]。因此對于NSCLCA需早期開展診斷，早期治療提高治療效果。血漿游離NDA為一種新發現的腫瘤標記物，有望在腫瘤疾病診斷中成為新的標記標準，因此本次重點分析NSCLCA患者檢測血漿游離DNA臨床意義，具體研究內容及結果如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月－12月期間我院收治的40例NSCLCA患者為研究組，患者經細胞學或者病理學診斷確定為NSCLCA，本次檢測分析前患者均未進行手術、化療以及放療等抗腫瘤治療。排除標準：病毒性肝炎；HIV等感染性疾病；全身系統性疾病等患者。腺癌患者21例，鱗癌患者19例；TNM臨床分期中，Ⅰ期患者11例Ⅱ期10例，Ⅲ期16例，Ⅳ期期患者3例。40患者中男性患者26例，女性患者14例，年齡39～78歲，平均（55.3±3.5）歲。另選取同期進行健康體檢的40例人群為對照組，男25例，女15例，年齡41～76歲，平均（50.1±2.9）歲，兩組人員均自愿進行本次檢測。兩組人員年齡、性別構成比等基本信息納入統計學分析軟件中分析，差異無統計學意義，結果具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 采樣 抽取清晨空腹靜脈血5ml，離心機進行10min 3000r/min離心，吸取上層血漿轉至無菌EP管中，然后在4℃12000r/min 下離心10min，吸取上清液置于-80℃冰箱中保存，以上操作在2h內進行完畢。

1.2.2 提取血漿游離DNA 采取QIAamp DNA Blood Midi Kit試劑盒按照說明書提取DNA。取血漿樣本500ul，依次調節50ul蛋白酶、500ul Buffer AL 以及500ul乙醇，最后加入50ul的Buffer AE進行洗脫，將提取的血漿游離DNA置于-20℃冰箱中保存備用。

1.2.3 血漿游離DNA水平測定 上游引物為5/-CCACACTGTGCCCATCTACG-3/，下游引物為5/-AGGATCTTCATGAGGTA GTCAGTCAG-3/，擴充產物為99bp長度，上海工生物工程技術服務公司提供引物序列、將DNA模板以及樣品分別配置RT-PCR反應體系，總反應體系為20ul，熒光PCR反應液為11ul，上下引物各1ul，DNA模板為1ul ddH2O 6ul，循環參數設置為95℃1min，95℃20s，60℃30s，68℃ 45s，進行40個循環反應。

1.2.3 標準曲線繪制[2]使用已知濃度的標準品繪制曲線，已知濃度獲得的ct與DNA含量為對數關系，采取PCR自帶分析軟件根據樣品ct獲得相關濃度。

1.3 數據分析

數據采用SPSS20.0統計軟件進行統計分析，計數資料采用率（%）表示，進行χ2檢驗，計量資料采用（±s）表示，進行t檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2.結果

2.1 患者與正常人之間血漿DNA水平比較

正常人群的血漿DNA水平值為（12.06±3.85）ng/ml，患者水平為（201.56±83.66）ng/ml,組間差異顯著（t=19.68,P=0.000）。

2.2 NSCLCA患者之間的血漿DNA水平比較

非小細胞肺癌患者中Ⅰ/Ⅱ水平低于Ⅲ/Ⅳ期（P＜0.05），其他因素之間水平差異無統計學意義（P＞0.05），見表。

表 NSCLCA患者之間的血漿DNAS水平值比較（±s，ng/ml）

表 NSCLCA患者之間的血漿DNAS水平值比較（±s，ng/ml）

資料血漿DNA水平tP性別男192.33±80.230.0390.065女201.23±97.65年齡（歲）≥60194.65±87.650.0450.061＜60205.66±89.66病理類型腺癌205.33±80.230.0210.085鱗癌199.68±81.23分期Ⅰ/Ⅱ170.23±71.223.1970.000Ⅲ/Ⅳ229.66±93.56

3.討論

對于肺癌患者而言，手術仍是治療最佳選擇，但由于非小細胞肺癌起病隱匿，發現時多數處于晚期，失去手術最佳機會。隨著醫療模式發展，新型化療藥物以及免疫抑制劑治療水平獲得明顯提高，使得肺癌患者治療方式出現更多選擇，但肺癌患者5年生存率僅為15%左右，總體效果不理想[3]。因此對于非小細胞肺癌患者進行早期篩查并盡早治療為最佳手段。

近年來腫瘤標記物在腫瘤疾病診斷中獲得廣泛應用，與影像學和病理學等見檢查方式比較，腫瘤標記物檢查具有操作簡單、價格低廉以及預測效果準確等優點。游離DNA是一種含有DNA雙螺旋系統的核苷酸片段，臨床研究顯示其是可能與多系細胞的凋亡相關，因此可通過該物質的水平值預測體內細胞凋亡情況[4]，因此可通過其水平值預測機體內細胞情況。本次研究中，健康人群體內血漿DNA水平值顯著低于非小細胞肺癌患者，患者的水平值高于正常人群可能是由以下原因造成：腫瘤細胞的凋亡或者壞死；腫瘤細胞自身釋放DNA；腫瘤細胞或者微轉移灶產生。以上產生的DNA進入血漿后導致檢測結果偏高。以上結果提示，后續早期非小細胞癌患者中可使用檢測血漿DNA水平判斷患者是否具有疾病，如水平值高于正常的10倍以上可懷疑為該疾病，應進行下一步檢查。非小細胞肺癌患者中Ⅰ/Ⅱ水平值低于Ⅲ/Ⅳ期，其他因素之間水平差異無統計學意義，說明血漿DNA水平值可判斷非小細胞肺癌患者疾病發展階段，但對于疾病類型以及誘發疾病的危險因素無預測價值，本次研究結果與前人報道基本一致。經以上結果分析我們認為：血漿游離DNA在非小細胞肺癌疾病診斷及臨床發展分析中均具有指導價值，但目前研究處于初級階段，該水平因子的檢測仍有具有一定局限性，臨床實際應用中需要聯合其他指標開展分析，提高診斷準確性。