炎癥性腸病患者CXCR1、IL-17 的表達及其意義

蔡清紅 馬松炎 鐘俊鋒

廣東省惠州市第三人民醫院消化內科，廣東惠州 516000

炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）是指一類病因不明的特發性慢性腸道炎癥性疾病，多累及回腸、結直腸部位，主要包括兩個獨立的疾病：潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）、克羅恩病（Crohn disease，CD）[1]。該病主要臨床特征包括腹痛、腹瀉、黏液血便等[2]。近年來，我國IBD 發病率呈不斷上升趨勢，且易反復性發作，對患者生活及工作造成嚴重不良影響[3]。據報道，該病可由疲勞、飲食失衡以及精神刺激和免疫異常等因素誘發，但多數患者為受到免疫異常影響而發病，患者主要表現出炎性細胞浸潤類型黏膜炎癥，并且有多種趨化因子以及其受體共同參與該病發展[4-5]。因此，深入探討IBD 發病機制，并尋找出和該病發病存在密切聯系的標志物，進而為其治療提供可靠新靶點，以提高臨床IBD 治療效果，是當前研究工作的重點。有學者指出[6-7]，CXC 趨化因子受體1（CXC chemokine receptor1，CXCR1）和白細胞介素-17（interleukin-17，IL-17）均參與IBD 發病，其中CXCR1屬于促炎多肽性細胞因子有關超家族的成員之一，其通常由造血微環境所含的基質細胞所分泌，能夠激活及趨化機體內白細胞的移動。而IL-17 主要由Th17細胞所分泌，可以激活和募集中性粒細胞不斷聚集在炎癥區域，同時引起或擴大機體的炎性反應。二者在IBD 中的具體表達作用仍需進一步分析。本研究通過分析CXCR1 和IL-17 在炎癥性腸病患者中的表達及其意義，旨在為臨床更好地治療IBD 提供數據支持，現報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

2016 年1 月～2017 年12 月惠州市第三人民醫院（以下簡稱“我院”）收治的80 例IBD 患者進行回顧性分析。入選標準：①所有患者的診斷均符合中華醫學會消化病學分會炎癥性腸病學組在2012 年時制定的IBD 診斷及治療共識意見[8]；②年齡≥18 歲；③近6 個月內就診次數＞3 次；④全部患者均處于疾病的活動期。排除標準：①合并其他種類的消化系統性疾病者；②有惡性腫瘤者；③有血液疾病者；④有其他嚴重的內科疾病者。IBD 患者中，UC 患者70 例，納入UC 組，其中男42 例，女28 例；年齡30～56 歲，平均（42.37±2.14）歲；病程3～7 個月，平均（4.30±1.47）個月。CD 患者10 例，納入CD 組，其中男7 例，女3 例；年齡32～57 歲，平均（42.41±2.03）歲；病程3～6 個月，平均（4.10±1.39）個月。另選同期在醫院進行結腸鏡檢查的健康志愿者50 例納入對照組，其中男36 例，女14 例；年齡31～55 歲，平均（42.50±2.12）歲。三組一般資料比較，差異無統計學意義（P ＞0.05），具有可比性。本研究經我院醫學倫理委員會批準。

1.2 實驗方法

1.2.1 主要試劑 cDNA 逆轉錄試劑盒（Fermentas 公司，生產批號：20150423）；real time PCR 試劑盒（Takara公司，生產批號：20151212）；CXCR1 兔抗人的多克隆抗體（Santa Cruz 公司，生產批號：20150129）；羊抗兔IgG（H+L）-HRP（天津三箭生物技術有限公司，生產批號：20150611）。

1.2.2 檢測各組血清IL-17 及CXCR1 mRNA 的表達抽取各組的空腹靜脈血約6 mL，用real time PCR 測定IL-17 及CXCR1 mRNA 的表達情況，相關引物序列均由Takara 公司提供。通過Trizol 法對靜脈血的RNA 進行提取，取RNA 產物約2 μL，用M-MLV逆轉錄酶常規合成cDNA，再由real time PCR 儀（CFX Connect，BioRad）實施熒光定量擴增，得到CT 值，并用2-△△Ct法進行計算。其中PCR 的反應參數為：預變性為95℃下5 min，變性為95℃下30 s，退火為56～62℃下30 s，延伸為72℃下1 min，共30 個循環，再給予10 min 72℃的終延伸。IL-17 引物序列：正向引物為：5′-TCGTCCACGGGTCCTCTCTCCC-3′；反向引物：5′-GTACAGTTTTGTAAACGATGG-3′。CXCR1 引物序列：正向引物：5′-CCCGTTGGATTACCAGACGAACG-3′；反向引物為：5′-CGGAAACTCTGTCCTCATGTCATGG-3′。將β-actin 作為內對照。

1.2.3 檢測各組腸黏膜IL-17 及CXCR1 mRNA 的表達 將提取的各組腸黏膜組織用real time PCR 法測定IL-17 及CXCR1 mRNA 表達，其中腸黏膜組織均取自結腸鏡的活檢組織，對照組取志愿者正常腸段的組織。檢測步驟同“1.2.2”，相關引物序列均由Takara公司提供，嚴格根據說明書的要求逐步實施。

1.2.4 蛋白免疫印跡法檢測腸黏膜組織CXCR1 蛋白的表達 通過蛋白免疫印跡法進行測定操作，將各組的20 mg 腸黏膜組織在研磨并粉碎之后添加100 μL冷蛋白裂解液（①50 mmol/L 的Tris-HCL；②pH 為7.5；③150 mmol/L 的NaCl；④1%的NP-40；⑤0.1%的SDS；⑥對每100 μL 的裂解液添加1 μL 100 mmol/L的PMSF 液），待其充分裂解之后給予3 min 4℃下10 000 r/min 的離心，離心半徑12.5 cm，提取上清液并檢測蛋白濃度。將40 μg 蛋白同上樣緩沖液進行混合，并煮沸5 min，給予SDS-PAGE，再電轉移到PVDF膜，用5%BSA 配制的脫脂牛奶予以封閉，再添加二抗行室溫孵育2 h，用TBST 緩沖液清洗3 次，最后用增強化學發光法進行曝光顯影，并應用Image J 軟件進行蛋白質定量分析。

1.3 觀察指標

比較各組血清及腸黏膜IL-17 及CXCR1mRNA表達水平，各組腸黏膜的CXCR1 蛋白表達水平，分析患者血清及腸黏膜IL-17 與CXCR1 表達的相關性。

1.4 統計學方法

采用SPSS 20.0 統計軟件進行數據分析，其中計數資料采用χ2檢驗；計量資料以均數±標準差（）表示；多組間比較采用方差分析，組間計量資料兩兩比較采用LSD-t 檢驗。采用Spearman 進行相關性分析，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組血清IL-17 及CXCR1 mRNA 表達水平比較

與對照組比較，UC 組及CD 組血清IL-17 mRNA表達水平升高（均P ＜0.05），但UC 組與CD 組比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）；各組血清CXCR1 mRNA表達水平比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。見表1。

表1 各組血清IL-17 mRNA 及CXCR1 mRNA 表達比較（）

表1 各組血清IL-17 mRNA 及CXCR1 mRNA 表達比較（）

注：與對照組比較，*P ＜0.05。IL-17：白細胞介素-17；CXCR1：CXC趨化因子受體1

2.2 各組腸黏膜IL-17、CXCR1 mRNA 表達及CXCR1 蛋白表達水平比較

與對照組比較，UC 組及CD 組腸黏膜IL-17 mRNA、CXCR1 mRNA 及CXCR1 蛋白表達水平升高（均P ＜0.05）；與CD 組比較，UC 組腸黏膜CXCR1 mRNA 及CXCR1 蛋白表達水平升高（P ＜0.05），但UC 組與CD 組腸黏膜IL-17 mRNA 表達水平比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。見表2。

表2 各組腸黏膜IL-17、CXCR1 mRNA 表達及CXCR1 蛋白表達水平比較（）

表2 各組腸黏膜IL-17、CXCR1 mRNA 表達及CXCR1 蛋白表達水平比較（）

注：與對照組比較，*P ＜0.05；與CD 組比較，#P ＜0.05。IL-17：白細胞介素-17；CXCR1：CXC 趨化因子受體1

2.3 患者血清及腸黏膜IL-17 mRNA 與CXCR1 mRNA 表達的相關性分析

Spearman 相關性分析發現，患者血清及腸黏膜IL-17 與CXCR1 表達呈正相關（r=0.435、0.505，P=0.043、0.038）。

3 討論

臨床將IBD 分為UC 以及CD 兩種類型，其中UC 為結腸黏膜層以及黏膜下層等出現的連續性炎性反應，其多數首先累及患者直腸，而后不斷向全結腸蔓延。而CD 則是累及整個消化道，屬于非連續性質全層炎癥，最易累及位置包括末端回腸以及結腸、肛周等。目前臨床對于該病發病機制以及治病因素等均無確切定論，有學者指出，該病的發病機制較復雜，主要是由環境、遺傳以及感染和免疫等多種因素共同導致[9-12]。同時，臨床研究顯示，腸道黏膜自身免疫系統發生異常反應，并引發系列炎性反應，是IBD 患者發病的關鍵[13-14]。因此，IBD 發病與免疫功能異常之間存在直接聯系，使得有關腸道免疫功能紊亂問題的研究成為當前IBD 疾病研究的重點。

本研究發現，與對照組比較，UC 組及CD 組血清IL-17 mRNA 表達水平更高（P ＜0.05），但UC 組與CD 組比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）；而UC 組及CD 組腸黏膜IL-17 及CXCR1 mRNA 表達水平與對照組比較明顯升高，且UC 組腸黏膜CXCR1 mRNA 表達水平較CD 組明顯更高（P ＜0.05），但IL-17 mRNA差異無統計學意義（P ＞0.05）。這與胡梅等[15]的報道結果一致。提示IL-17 及CXCR1 均可能參與到IBD的發病過程中，但二者的作用機制有所差異。CXCR1能夠特異性地結合IL-17，并介導相應的中性粒細胞趨化和磷脂酶D 的活化，及超氧化物的形成，在IBD中重點參與到UC 的發病過程當中，并與UC 的活動性緊密相關[16]。而IL-17 則主要可能是通過促進白細胞釋放過量的化學因子引起組織炎癥的發生，最終強化了腸道內的炎性反應而導致IBD 的形成[17]。同時，本文還發現，與對照組比較，UC 組及CD 組腸黏膜CXCR1 蛋白表達水平升高（P ＜0.05），且UC 組較CD組更高（P ＜0.05），再次提示了CXCR1 蛋白雖然可參與到IBD 的發病，但以UC 為主。進一步分析發現，患者血清及腸黏膜IL-17 與CXCR1 mRNA 表達呈正相關。這提示了炎癥因子與趨化因子之間存在著一定程度的聯系，主要由于多種炎癥細胞不斷向腸道轉移，并且釋放出大量趨化因子。以上炎癥細胞以及趨化因子等共同參與IBD 發生，并造成炎癥損傷[18]。趨化因子是指一種通過組織細胞以及炎癥細胞合成并分泌，具備對炎癥細胞進行趨化募集以及活化等功能的蛋白質，其能夠和相應受體相結合，并誘導炎癥細胞不斷趨化游走，介導其向發生炎癥位置聚集，并且活化[19]。CXC為趨化因子一個典型亞家族，與其相結合的受體則是CXC 受體，CXCR1 為其中一個類型。CXC 與CXCR 可以互相結合并發揮出一定生物學功能，且對炎性反應產生一定作用[20-21]。IL-17 則具備較高的炎癥活性，其可通過引起下游多類細胞因子及趨化因子表達，不斷招募機體的中性粒細胞和巨噬細胞遷移至炎癥部位區域，從而產生組織損傷，而腸道內的微生物及局部性的細胞因子微環境則共同促使了IL-17 的表達[22]。因此，監測CXCR1 和IL-17 有利于更好地輔助治療IBD。這在Verstockt 等[23]的報道中也有類似的結論可加以佐證。

綜上所述，IBD 患者CXCR1 和IL-17 呈高表達，且患者血清及腸黏膜的IL-17 與CXCR1 表達呈正相關，臨床上可考慮監測CXCR1 和IL-17 水平，從而更好地輔助治療IBD。