對(duì)比劑腎病大鼠腎臟bax 及bcl-2 表達(dá)及羥苯磺酸鈣干預(yù)研究

李 偉 于芬芬 季文萱 何曉艷 潘配強(qiáng)， 孫 艷 黃俊彥

1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東青島 266021；2.山東省臨沂市平邑縣中醫(yī)醫(yī)院腎內(nèi)科，山東平邑 273300；3.青島市中心醫(yī)院腎內(nèi)科，山東青島 266042；4.青島市市立醫(yī)院腎內(nèi)科，山東青島 266011

隨著介入手術(shù)治療推廣和完善，術(shù)中造影劑導(dǎo)致腎功能損傷明顯增加，由造影劑導(dǎo)致的腎病目前已成為腎功能不全的第三位原因，特別是對(duì)糖尿病腎病、腎功能損傷、充血性心力衰竭等高危患者，發(fā)生率可高達(dá)50%[1]。對(duì)比劑腎病（CIN）發(fā)病機(jī)制尚不明確，且缺乏有效治療措施。研究表明，細(xì)胞凋亡與CIN 的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，但具體機(jī)制尚不清楚[2]。羥苯磺酸鈣為微循環(huán)改善劑及抗氧化劑，具有抗細(xì)胞凋亡的作用[3]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立CIN 大鼠模型，旨在探討CIN 大鼠腎臟bax 及bcl-2 的表達(dá)及羥苯磺酸鈣干預(yù)效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：84 只清潔級(jí)、雄性Wistar 大鼠，體重（220±20）g，鼠齡8～10 周，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK-（京）2012-0001]，合格證號(hào)：11001 1171100273。在（23±2）℃環(huán)境中采用12 h 晝夜節(jié)律飼養(yǎng)，自由地飲水與進(jìn)食，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及條件符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l件》要求，且經(jīng)青島大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。試劑：羥苯磺酸鈣（海南林恒制藥），bax、bcl-2 抗體（博士德），760 g/L 泛影葡胺（上海旭東海普藥業(yè)），吲哚美辛（INDO）購(gòu)自Sigma（美國(guó)），N-硝基-LL-精氨酸甲酯（L-NAME）購(gòu)自Sigma（美國(guó)），TUNEL 試劑盒（Roche，生產(chǎn)批號(hào)：J180573）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組 84 只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組（A 組）、模型組（B 組）和羥苯磺酸鈣干預(yù)組（C 組），每組28 只。造模當(dāng)天將B 組和C 組大鼠尾靜脈植入1 枚留置針，間斷15 min 順次將INDO、L-NAME、760 g/L 泛影葡胺進(jìn)行注射，劑量為10 mg/kg。CIN 造模成功標(biāo)準(zhǔn)：注射對(duì)比劑后48 h 的血清肌酐（Scr）升高≥25%或Scr 絕對(duì)值升高≥44.2 μmol/L[4]。A 組將760 g/L 泛影葡胺更換為生理鹽水造模。C 組于造模前3 d 與當(dāng)天給予羥苯磺酸鈣進(jìn)行灌胃，劑量100 mg/（kg·d），A 和B 組等體積生理鹽水灌胃。

1.2.2 標(biāo)本收集 分別于造模后12、24、48、72 h 批量處死，腹主動(dòng)脈取血，常規(guī)取腎臟，1/4 的組織浸泡10%中性甲醛浸泡，剩余腎臟組織液氮速凍，-80℃儲(chǔ)存。

1.2.3 血清生化指標(biāo)檢測(cè) 采用上述步驟各實(shí)驗(yàn)點(diǎn)留取血樣，監(jiān)測(cè)血清尿素氮（BUN）和Scr 水平。

1.2.4 病理檢查 采用石蠟包埋，切片，制備成為病理觀察切片，并采用HE 染色（上海研域化學(xué)試劑有限公司），光學(xué)顯微鏡觀察。

1.2.5 腎細(xì)胞凋亡監(jiān)測(cè)（TUNEL）選擇造模后48 h 腎組織，采用甲醛固定后，制備成為組織切片，經(jīng)水合、脫蠟等過(guò)程，TUNEL 反應(yīng)液添加入切片組織，辣根過(guò)氧化酶（熒光素抗體標(biāo)記）處理，二氨基聯(lián)苯胺顯色，光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取（400×）視野5 個(gè)，觀察計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)。

1.2.6 bax、bcl-2 蛋白組織表達(dá)水平測(cè)定 取上述病理切片，充分脫蠟，1%甲醇雙氧水處理、抗原修復(fù)液修復(fù)、封閉、添加一抗（兔抗大鼠bax/bcl-2，南京建成生物科技公司）、二抗（河北博海生物工程開(kāi)發(fā)有限公司）；鏈霉卵白素（辣根酶標(biāo)記，杭州聯(lián)科生物技術(shù)公司）工作液處理，DAB 顯色（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），蘇木精復(fù)染，封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.7 bax、bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量（Western blot）將各腎組織經(jīng)過(guò)研磨、分離、沉淀等步驟獲得含有bax、bcl-2 蛋白的上清液，95℃水浴變性；SDS-PAGE凝膠80V 進(jìn)行電泳，蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜，順次加入一抗（兔抗大鼠bax/bcl-2，南京建成生物科技公司）、二抗（南京建成生物科技公司）；ECL 法（深圳達(dá)科為生物技術(shù)股份公司）測(cè)定其免疫活性，曝光、洗膜、顯影等過(guò)程后，UVP 分析儀測(cè)定灰度值，選擇β-actin 基因作為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，各組比較采用重復(fù)測(cè)量的方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q 檢驗(yàn)。以P <0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清生化指標(biāo)水平比較

B 組和C 組造模后12、24、48、72 h 血清BUN 和Scr 水平顯著高于A 組同期，C 組造模后12、24、48、72 h 血清BUN 和Scr 水平顯著低于B 組同期（P <0.05）；與造模后12 h 比較，B 組和C 組造模后24、48、72 h 血清BUN 和Scr 水平均顯著升高（P <0.05）；與造模后24 h 比較，B 組造模后48 h 血清Scr 水平顯著升高，C 組造模后48 h 血清BUN 和Scr 水平均顯著升高，C 組造模后72 h 血清Scr 水平顯著降低（P <0.05）；與造模后48 h 比較，B 組和C 組造模后72 h 血清BUN 和Scr 水平均顯著降低（P <0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清生化指標(biāo)水平比較（）

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清生化指標(biāo)水平比較（）

注：與同組造模后12 h 比較，*P<0.05；與同組造模后24 h 比較，△P <0.05；與同組造模后48 h 比較，#P <0.05；與A 組同期比較，■P <0.05；與B 組同期比較，★P <0.05。Scr：肌酐；BUN：尿素氮

2.2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)病理變化

A 組病理改變不顯著；B 組造模后12 h 出現(xiàn)廣泛腎小管上皮細(xì)胞空泡樣變性、部分腎小管壞死，腎間質(zhì)纖維化；C 組腎小管間質(zhì)病變顯著改善。見(jiàn)圖1。

2.3 各組大鼠造模后48 h 腎細(xì)胞凋亡情況

A 組大鼠腎細(xì)胞無(wú)明顯凋亡；B 組大鼠腎細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著高于A 組，C 組腎細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著低于B 組，但高于A 組（P <0.05）。見(jiàn)圖2。

圖1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)病理變化（HE 染色，400×）

圖2 各組大鼠造模后48 h 腎細(xì)胞凋亡情況（TUNEL，400×）

2.4 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腎組織bax、bcl-2 免疫組化積分吸光度表達(dá)水平比較

B 組大鼠bax 表達(dá)水平顯著高于A 組，C 組bax表達(dá)水平顯著低于B 組，但高于A 組（P <0.05）；B 組大鼠bcl-2 表達(dá)水平顯著低于A 組，C 組bcl-2 表達(dá)水平顯著高于B 組，但低于A 組（P <0.05）。見(jiàn)圖3。

2.5 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腎組織bax、bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

B 組大鼠bax 蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于A 組，C 組bax 蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著低于B 組，但高于A 組（P <0.05）；B 組大鼠bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著低于A 組，C 組bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于B 組，但低于A 組（P<0.05）。見(jiàn)圖4～5。

圖3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腎組織bax、bcl-2 免疫組化積分吸光度表達(dá)水平比較（n=7）

圖4 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腎組織bax、bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量

圖5 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腎組織bax、bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（n=7）

3 討論

CIN 為目前腎功能損傷常見(jiàn)疾病，但目前發(fā)病原理尚不明確，與腎組織血流分布、自由基損傷、炎癥侵襲等有關(guān)，CIN 細(xì)胞凋亡是主要發(fā)病原因[5-8]。為增加造影劑對(duì)腎臟血流的持續(xù)性減少，注射INDO 和LNAME 可有效阻斷前列腺素和一氧化氮合成酶，制備持久性的腎功能衰竭大鼠模型[7]。在本實(shí)驗(yàn)中，B 組相對(duì)于A 組，其腎小管上皮細(xì)胞的凋亡程度加劇，凋亡指數(shù)上升明顯，提示細(xì)胞凋亡可能參與CIN 的發(fā)生、發(fā)展，與相關(guān)研究結(jié)果一致[6，9-14]。

bcl-2 是細(xì)胞凋亡過(guò)程中重要的調(diào)節(jié)元件，與bax蛋白的表達(dá)量相對(duì)穩(wěn)定，促凋亡因子的bax 在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)增加時(shí)，造成細(xì)胞死亡信息被放大，細(xì)胞凋亡啟動(dòng)；而作為抗凋亡因子的bcl-2 表達(dá)增加時(shí)對(duì)抗其誘導(dǎo)凋亡的作用，延長(zhǎng)細(xì)胞存活期[15-18]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)CIN 大鼠腎組織bax 和bcl-2 的表達(dá)情況，進(jìn)一步證實(shí)細(xì)胞凋亡與CIN 的發(fā)生關(guān)系密切，提示對(duì)比劑可能通過(guò)增加bax 表達(dá)、降低bcl-2 表達(dá)誘導(dǎo)CIN 大鼠腎細(xì)胞凋亡[6，19]。

羥苯磺酸鈣作為一種血管保護(hù)性藥物，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡使原發(fā)性靜脈曲張，保護(hù)腎臟[20-21]。通過(guò)HE染色及TUNEL 染色觀察到腎損傷主要為腎小管間質(zhì)病變，與B 組比較，C 組大鼠腎病理改變及腎小管上皮細(xì)胞凋亡明顯減輕，說(shuō)明羥苯磺酸鈣對(duì)CIN 大鼠具有保護(hù)作用。bax 表達(dá)明顯升高，而bcl-2 表達(dá)明顯下降，說(shuō)明bax、bcl-2 調(diào)控的細(xì)胞凋亡可能參與CIN 的發(fā)生、發(fā)展。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，羥苯磺酸鈣可能通過(guò)減少bax 的表達(dá)及增加bcl-2 表達(dá)減輕CIN 模型大鼠腎細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮對(duì)CIN 大鼠的保護(hù)作用。

綜上所述，bax、bcl-2 調(diào)控的細(xì)胞凋亡參與CIN的發(fā)生、發(fā)展，羥苯磺酸鈣阻斷bax 表達(dá)，上調(diào)bcl-2表達(dá)，發(fā)揮保護(hù)作用。