不同促透劑對根皮素體外透皮吸收的影響

關 波 皇甫俊茹 徐 媛 周雪姣 劉雪英 王慶偉

1.空軍軍醫大學第二附屬醫院藥劑科，陜西西安 710038；2.西安金花制藥廠生產部，陜西西安 710065；3.西安市胸科醫院藥劑科，陜西西安 710075；4.空軍軍醫大學藥學系藥物化學與藥物分析學教研室，陜西西安 710032

根皮素（Phloretin）是一種主要存在于梨、蘋果、金橘果皮或根皮及多種蔬菜中的類黃酮化合物[1-2]，其化學結構含有4 個酚羥基，決定了其較強的抗氧化活性[3-5]。研究發現，根皮素具有多種生物學活性，對癌細胞具有抑制作用[6-7]，對皮膚光損傷具有保護作用[8]，對心血管系統、高脂血癥和骨質疏松等疾病也具有一定的治療作用[9-11]。透皮給藥可以顯著減少藥物的首過效應和不良反應，從而使藥物以恒定速度透過皮膚進入體內產生藥理作用[12-13]。本文擬分別考察氮酮、冰片、薄荷醇、麝香酮4 種促透劑對根皮素透過SD 大鼠皮膚的促透效應，篩選出最優促透劑，為根皮素系列經皮給藥制劑研發提供依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260 Infinity 液相色譜系統（Agilent，American；包含Agilent 1260 泵、Agilent 1260 DAD 二極管陣列檢測器、Agilent 1260 色譜工作站）；Franz YB-P6智能透皮實驗儀（天津標準儀器制造廠）；電子天平（德國Sartorius 公司，精度0.1 mg）；電子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度0.01 mg）。

1.2 試劑

根皮素對照品（空軍軍醫大學藥化教研室提供，含量99.00%，批號：20170922）；根皮素原料（空軍軍醫大學藥化教研室提供，含量98.70%，批號：20170910）；氮酮（天門科捷制藥有限公司）；薄荷醇（天津市福晨化學試劑廠）；冰片（天津市登峰化學品有限公司）；麝香酮（湖北夢盛化工）；辛酸葵聚乙二醇甘油酯（法國嘉法師）；生理鹽水（西安京西雙鶴藥業有限公司）；無水乙醇（天津市富宇精細化工有限公司，分析純）；乙腈（美國Tedia 公司，色譜純）；色譜用超純水自制。

1.3 實驗動物

2 月齡雄性SD 大鼠，18 只，SPF 級別，體重200～220 g，合格證號：37009200001779。購自空軍軍醫大學動物實驗中心[許可證號：SCXK（軍）2014-007]。自由飲食和進食，室溫保持在（25±3）℃。

2 方法與結果

2.1 HPLC 法測定樣品中根皮素的含量

2.1.1 溶液的制備 精密稱量根皮素對照品5.20 mg，置于10 mL 棕色容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，得濃度為520.0 μg/mL 根皮素母液，4℃冰箱中保存待用。

2.1.2 色譜條件 色譜柱：Iinertsil ODS-3（150 mm×4.6 mm，5 μm）；C18保護柱（10 mm ×4.6 mm，江蘇漢邦）；流動相：乙腈-水（45∶55）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：280 nm，進樣量：20 μL，柱溫：25℃。

2.1.3 專屬性 取適當濃度的根皮素對照品30%乙醇-生理鹽水（EPS）溶液、根皮素透皮吸收接收液和甲醇溶液，色譜條件下進樣，記錄色譜圖。結果顯示，根皮素色譜峰基線分離完全，tR 為3.8 min，其他成分不干擾根皮素的測定（圖1）。

2.1.4 標準曲線制備與線性范圍的確定 精密量取根皮素對照品母液適量，用30%EPS 溶液逐步稀釋成0.1030、0.5148、2.574、5.148、17.16、34.32、51.48 μg/mL系列溶液。色譜條件下進樣，根皮素峰面積Y 對濃度C進行回歸，回歸方程為：Y=86.45C+3.901（r=0.9999），根皮素在0.1030～51.48 μg/mL 濃度范圍內線性關系良好。

圖1 根皮素對照品及樣品色譜圖（根皮素色譜峰）

2.1.5 精密度實驗 取濃度分別為0.1030、5.148、51.48 μg/mL 的根皮素對照品30% EPS 溶液，于同一天重復進樣5 次，連續3 d，每個樣品各進樣5 次，計算日內和日間精密度。結果見表1。所有RSD 均＜2.0%，表明該方法的精密度良好。

表1 根皮素測定方法精密度（n=5）

2.1.6 穩定性實驗 取根皮素的甲醇和30% EPS 溶液，在室溫下放置0、2、4、8、12、24 h，色譜條件下分別測定根皮素峰面積。24 h 峰面積的RSD 分別為0.912%和0.934%（n=5），表明根皮素甲醇和30%EPS 溶液在室溫下24 h 內穩定性良好。

2.1.7 加樣回收率實驗 取12 h 透皮接收液（根皮素含量為15.28 μg/mL）9 份，每份1.0 mL，置于5 mL 量瓶中，分為3 組，每組分別加入根皮素對照品30%EPS溶液（濃度為17.16 μg/mL）0.80、1.00、1.20 mL，加30%EPS 溶液至刻度，搖勻，測定根皮素含量。計算得平均回收率為99.36%。RSD 為1.02%（n=9）。

2.2 透皮吸收實驗

2.2.1 皮膚的制備 健康SD 大鼠用乙醚麻醉，剪取劍突以下腹部去毛皮膚。剔除皮下脂肪組織及黏膜，生理鹽水沖洗至皮膚洗液不再白色渾濁，濾紙吸干皮膚表面，透過燈光檢查皮膚完整性，選取適當大小無損傷的皮膚備用。

2.2.2 藥物溶液的制備 30%EPS 溶液中加入Labrasol（含量1.0%），作為基礎溶液。取多份適量基礎溶液加入根皮素和不同促透劑，根皮素的含量均為30 mg/mL，氮酮、冰片、薄荷醇、和麝香酮的含量分別是0.0%、1.0%、2.0%、4.0%，超聲混合均勻后待用。

2.2.3 促透劑促進根皮素透皮吸收實驗 設定Franz 擴散池系統溫度為（37.0±0.2）℃，攪拌子轉速為300 r/min（長度為1.0 cm）。SD 大鼠皮膚角質層向上固定于供藥池和接收池之間，接收池中注入30%EPS 溶液，真皮一側與接收液充分接觸。系統溫度恒定后，供藥池中加入1.0 mL 供試液。恒速攪拌并開始計時，分別于1、2、4、6、8、12 h 抽取接收液1.0 mL，同時補加1.0 mL已預熱至37℃的30%EPS 溶液，排凈氣泡。HPLC 測定接收液樣品中根皮素的含量，按下式計算單位面積累計透過量（Qn）：式中，Cn為第n個取樣點測得的根皮素濃度（μg/mL）；V 為接收液體積（17.0 mL）；Ci為第i 個取樣點測得的根皮素濃度（μg/mL）；Vi為取樣體積（1.0 mL）；A 為滲透面積（1.67 cm2）。將Qn對時間t 進行回歸，Qn-t 方程斜率即為根皮素的透皮速率常數Jss[μg/（cm2·h）]。根皮素的滲透系數為Kp=Jss/C，C 為供藥池的藥物濃度；增滲倍數為ER=KP/KP0，KP為加促透劑后根皮素的滲透系數，KP0為根皮素固有的滲透系數。供試液中根皮素濃度相同，故ER 為透皮速率常數之比，即ER=J促透劑組/J對照組。

2.3 結果

2.3.1 氮酮對根皮素的促透結果 不同濃度氮酮對根皮素透過大鼠皮膚均具有不同程度的促進作用，與不含氮酮的對照液比較，隨著氮酮濃度的增大，促透效應越強。Qn與時間t 呈較好線性關系，r 值均＞0.92。見表2、圖2 和表3。

表2 氮酮促根皮素離體大鼠皮膚的單位面積累積透過量（n=3）

圖2 氮酮促根皮素離體大鼠皮膚的單位面積累積透過量

表3 氮酮作用下根皮素透過大鼠皮膚的動力學參數

2.3.2 薄荷醇對根皮素的促透結果 不同濃度薄荷醇對根皮素透過大鼠皮膚均具有不同程度的促進作用，與不含薄荷醇的對照液比較，隨著薄荷醇濃度的增大，促透效應越強。Qn與時間t 呈較好線性關系，r 值均＞0.86。見表4、圖3 和表5。

表4 薄荷醇促根皮素離體大鼠皮膚的單位面積累積透過量（，n=3）

表4 薄荷醇促根皮素離體大鼠皮膚的單位面積累積透過量（，n=3）

2.3.3 冰片對根皮素的促透結果 不同濃度冰片對根皮素透過大鼠皮膚均具有不同程度的促進作用，與不含冰片的對照液比較，隨著冰片濃度的增大，促透效應越強。Qn與時間t 呈良好線性關系，r 值均＞0.88。4.0%時冰片的透皮速率相對較大：4.0%>2.0%>1.0%>0.0%。見表6、圖4 和表7。

圖3 薄荷醇促根皮素離體大鼠皮膚的單位面積累積透過量

表5 薄荷醇促根皮素的滲透動力學參數

表6 冰片促根皮素離體大鼠皮膚的單位面積累積透過量（，n=3）

表6 冰片促根皮素離體大鼠皮膚的單位面積累積透過量（，n=3）

注：“-”表示無數據

圖4 冰片促根皮素離體大鼠皮膚的單位面積累積透過量

表7 冰片促根皮素的滲透動力學參數

2.3.4 麝香酮對根皮素的促透結果 不同濃度麝香酮對根皮素透過大鼠皮膚均具有不同程度的促進作用，與不含麝香酮的對照液比較，隨著麝香酮濃度的增大，促透效應越強。Qn與時間t 呈良好線性關系，r 值均＞0.90。4.0%時麝香酮的透皮速率相對較大：4.0%>2.0%>1.0%>0.0%。見表8、圖5 和表9。

表8 麝香酮促根皮素離體大鼠皮膚的單位面積累積透過量（，n=3）

表8 麝香酮促根皮素離體大鼠皮膚的單位面積累積透過量（，n=3）

圖5 麝香酮促根皮素離體大鼠皮膚的單位面積累積透過量

表9 麝香酮促根皮素的滲透動力學參數

3 討論

根皮素結構中含有多個酚羥基，是親脂性化合物，易溶于醇類中，在乙醇中有較好的溶解度[14]，為了增加根皮素在供給液及接收液中的溶解度，選擇30%EPS 作為實驗供給液和接收液的溶劑。氮酮、冰片、薄荷醇、麝香酮4 種促透劑相對于水均為低密度脂溶性物質，不能完全溶于供試溶液中形成均一體系，實驗過程中不能與皮膚充分接觸，因此在供試液體系中加入表面活性劑Labrasol，發揮其增溶和乳化作用，使供試液為均一體系。

化合物自身的理化性質是影響化合物透過皮膚屏障的關鍵因素，一般分子量與藥物的經皮擴散速度呈負相關，脂水分配系數在lgP 為1～3 時能較好透過皮膚[15]。已有研究表明，根皮素可以改變細胞膜的通透性，也作為滲透增強劑，被廣泛用于局部透皮給藥制劑中[16]，但根皮素自身透皮吸收較差。促透劑的選擇是透皮吸收的關鍵，本文選擇不同促透劑機制的促透劑，考察其對根皮素透皮吸收的促進效應。薄荷醇屬于單萜類化合物，研究發現一般在1%～5%范圍內其促透效果與劑量呈效應關系，其促透作用隨著濃度增大而增強[17]。氮酮能使角質層的類脂質產生不規則排列，增強角質層的流動性，有利于藥物透過角質層[18]，冰片的促透機制是提取和擾亂角質層類脂[19]，麝香酮可以選擇性改變皮膚阻力問題[20]。

實驗考察的四種促透劑對根皮素均有促透皮效應，且促透作用隨促透劑的濃度增加而增加，在實驗考察的范圍內，每一種促透劑濃度為4.0%的促透作用較大。以增滲倍數為指標，促透劑濃度為1.0%時促透效應為薄荷醇>麝香酮>冰片>氮酮；促透劑濃度為2.0%時促透效應為薄荷醇>冰片>氮酮>麝香酮；促透劑濃度為4.0%時促透效應為薄荷醇>氮酮>冰片>麝香酮。結果表明，薄荷醇對根皮素透過皮膚的促進作用最好，其次為冰片和氮酮。但是，冰片和薄荷醇均有強烈的皮膚清涼感，當濃度過大時皮膚難以接受，因此，在制劑研發時有必要依據產品的需求進一步考察合適用量或多個促透劑聯合應用。