基于腸道菌群結構特征研究胰腺癌不同中醫證型與預后的相關性

陳 卓 錢 祥 張愛琴 傅曉璇 甄宏德

胰腺癌（pancreatic cancer，PC）生長迅速，侵襲性強，惡性程度高，具有臨床表現隱匿、預后極差的特點[1]。胰腺癌確診時已為晚期的患者術后1 年生存率為30%～40%，2 年生存率不足20%，5 年生存率僅為5%左右[2]。近年來，中醫在惡性腫瘤治療中的優勢逐漸顯現，已成為胰腺癌的重要治療手段[3]。

“辨證論治”是中醫治療胰腺癌的理論核心。隨著基因組學、代謝組學、腸道微生態方面研究的發展，為胰腺癌證候的研究提供新的技術平臺。本文旨在利用現代生物手段分析胰腺癌不同中醫證型腸道菌群結構特征及總生存期差異，探究兩者間的內在聯系，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 抽取2018 年1 月1 日—2018 年9月30 日在浙江省腫瘤醫院腹部腫瘤放療科及腹部腫瘤內科收治的符合納入標準的胰腺癌患者36 例，根據中醫證型分為氣血瘀滯組12 例、脾虛濕熱組11例及濕熱內蘊組13 例。另設浙江中醫藥大學研究生正常健康人群8 名作為健康對照組。本臨床研究經浙江省腫瘤醫院倫理委員會審核通過，倫理批件號為IRB-2018-194。

1.2 納入標準（1）胰腺癌患者入組標準：年齡18～70 歲；經組織病理學和（或）細胞學證實為胰腺癌[4]的患者；非其他部位腫瘤轉移至胰腺部；符合中醫辨證分型[5]為濕熱內蘊證、氣血瘀滯證及脾虛濕熱證之一的患者；簽署知情同意書。（2）正常健康人群入組標準：年齡18～70 歲；無消化道、心腦血管或其他主要臟器系統的病史；近1 個月內無胃腸病史，無腹瀉、無應用抗生素等藥物及服用腸道微生態調節劑；無吸煙、飲酒等嗜好；舌質淡紅苔薄白，脈象正常。

1.3 排除標準（1）合并心、腦、肝、腎或造血系統等重大內科疾病患者；（2）患有精神疾病患者。

1.4 退出標準（1）患者依從性差，自行要求終止試驗；（2）中醫證型改變。

1.5 中醫辨證分型 中醫辨證分型參照相關文獻[5]分為三型：氣血瘀滯證、脾虛濕熱證及濕熱內蘊證。（1）氣血瘀滯證：左上腹部疼痛明顯，痛有定處，呈刺痛或脹痛，腹痛可隨情緒變化而有所增減，或夜間痛甚，痞塊疼痛拒按，舌紫暗或有瘀斑、瘀點，苔薄，脈弦或細澀；（2）脾虛濕熱證：消瘦，神疲乏力，胃納不佳，腹脹，食后尤甚，便溏甚或如水樣，身體困重，身熱不揚，舌淡胖，苔黃滑，脈濡而無力；（3）濕熱內蘊證：脘腹脹悶，惡心納呆，口黏不爽，渴不多飲，小便短黃，大便干結或黏滯，或見面目發黃色鮮明，或有身熱不揚，汗出熱不解，舌質紅，苔黃膩，脈滑數。中醫證型由三名副主任及以上中醫師確認。

1.6 儀器及試劑 KAPA HiFiHotstartReadyMix PCR kit 高保真酶（Kapa Biosystems，KK2602），離心機（XiangYi H1650-W），Light Cycler 96 PCR 儀（Roche，Applied Biosystems Veriti Thermal Cycler（Life Technologies），電泳儀（Tanon，DYY-6C）凝膠成像儀（Tanon），NanoDrop 2000 Spectrophotometer（Thermo Scientifc)，Qubit2.0 Fluorometer（Invitrogen），2100 Bioanalyzer（Agilent），Miseq Reagent Kit PE300 v3 試劑盒（Illumina，MS-102-3003），QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit 試劑盒（Qiagen，51604），AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒（Axygen，ASJ0013），Illumina HiSeq2500 PE250 高通量測序儀（Illumina，Inc，CA，USA），含Qiime 分析軟件（Qiime1.9.1）的計算機（Dell）等。

1.7 檢測方法 采集受試者糞便，經處理后，進行基因組DNA 提取和質檢，進行PCR 擴增和產物純化，用Illumina HiSeq PE250 平臺進行16S rDNA 測序。

Usearch 聚類時，根據豐度從大到小先將序列進行排序，然后通過97%的相似度聚類，得到OTU。將OTU 與RDP 數據庫比對，對每個OTU 進行物種分類，得到物種豐度表，進行后續分析。根據每個樣本文庫中的OTU 豐度信息，使用Shannon Index 和稀疏性曲線來評估文庫的多樣性，使用Qiime 軟件來計算Shannon Index，使用aRarefactWin 軟件來計算稀疏性曲線。各樣品間微生物群落結構的差異采用Unweighted Unifrac PCoA 法分析。

1.8 隨 訪 隨訪患者，統計其總生存時間，生存起始時間為首次經穿刺活檢或手術病理證實為胰腺癌的時間，終點時間為患者死亡，隨訪結束即截尾時間為2019 年2 月1 日。

1.9 統計學方法 用SPSS 16.0 軟件進行數據分析。滿足正態分布，方差齊性的定量資料用獨立樣本t 檢驗。不滿足正態分布的資料用非參數檢驗。使用秩和檢驗方法對不同分組之間進行顯著性差異分析，找出對組間劃分產生顯著性差異影響的物種，采用R 語言stats 包的kruskal.test 函數找出不同組間有明顯差異的物種。用Log rank 法比較不同組間總生存時間的差異。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胰腺癌不同中醫證型患者一般資料比較 收集胰腺癌患者36 例，排除或退出共8 例，最終納入28例，其中氣血瘀滯組9 例，脾虛濕熱組9 例，濕熱內蘊組10 例。胰腺癌不同中醫證型患者在性別、年齡、分期等一般資料上差異均無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 胰腺癌不同中醫證型患者一般資料比較

2.2 OTU 韋恩圖分析 本研究中36 個樣品（氣血瘀滯組、脾虛濕熱組、濕熱內蘊組及健康對照組各含樣品9、9、10、8 個）共產生796 個OTU。四組之間相似的OTU 占30%，四組共有的OTU 為241 個。不同組間也確實存在一些OTU 是其他組所沒有的，初步說明胰腺癌不同中醫證型患者及健康對照組四組之間OTU 具有一定的差異。

圖1 OTU 韋恩圖

2.3 物種組成分析 氣血瘀滯組豐度最高的前5 個屬依次是擬桿菌屬（Bacteroides），普氏菌屬（Prevotella），普拉梭菌屬（Faecalibacterium），雙歧桿菌屬（Bifidobacterium），羅斯氏菌屬（Roseburia）；脾虛濕熱組豐度最高的前5 個屬依次是擬桿菌屬（Bacteroides），鏈球菌屬（Streptococcus），埃希氏菌屬/志賀氏菌屬（Escherichia/Shigella），克雷伯氏菌屬（Klebsiella），普氏菌屬（Prevotella）；濕熱內蘊組豐度最高的前5 個屬依次是擬桿菌屬（Bacteroides），埃希氏菌屬/志賀氏菌屬（Escherichia/Shigella），克雷伯氏菌屬（Klebsiella），普拉梭菌屬（Faecalibacterium），梭菌屬XIVa（ClostridiumXIVa）；健康對照組豐度最高的前5 個屬依次是擬桿菌屬（Bacteroides），普氏菌屬（Prevotella），普拉梭菌屬（Faecalibacterium），羅斯氏菌屬（Roseburia），克雷伯氏菌屬（Klebsiella）。

圖2 不同分組屬水平上物種豐度組成柱狀圖

2.4 差異物種分析 組間差異性物種分別是產堿桿菌屬（Alcaligenes）、氣球菌屬（Anaerococcus）、奇異菌屬（Atopobium）、彎曲桿菌屬（Campylobacter）、柯林斯氏菌屬（Collinsella）、鐮刀菌屬（Fusicatenibacter）、孿生球菌屬（Gemella）、芽殖菌屬（Gemmiger）、顆粒鏈菌屬（Granulicatella）、纖毛菌屬（Leptotrichia）、分枝桿菌屬（Mogibacterium）、臭桿菌屬（Odoribacter）、錐體菌屬（Pyramidobacter）、羅氏菌屬（Roseburia）、茄桿菌屬（Solobacterium）、鏈球菌屬（Streptococcus），見表2。

2.5 總生存期差異分析 用Log rank 法比較胰腺癌三種中醫證型的總生存期差異，結果顯示，脾虛濕熱組的中位生存時間為8 個月（95%置信區間：4.167-11.833），比氣血瘀滯組的12 個月（95%置信區間：8.013-15.987）和濕熱內蘊組的18 個月（95%置信區間：5.658-30.342）都要短。三組的總生存期差異具有統計學意義（χ2=7.092，P=0.029），具體而直觀的生存曲線圖。

圖3 生存曲線圖

3 討論

胰腺癌在古籍文獻中雖未見直接記載，但根據其臨床特點，可歸于中醫“伏梁”“積聚”“腹痛”“黃疸”等范疇[6]。胰腺癌的臨床表現主要有腹痛、黃疸、消瘦、乏力以及食欲不振、腹脹、便秘或腹瀉等消化系統的癥狀。對胰腺癌病因病機的認識，則不外乎內因（飲食不節、情志失度、病久虛損等）、外因（濕熱侵襲等）兩方面多因素復雜作用的結果[7]。關于胰腺癌的中醫辨證分型，由于各醫家所處氣候、地域、生活習慣、風俗文化等的差異，及對胰腺癌病因病機的認識和臨床經驗的不同，目前尚無統一的辨證標準。金莉[5]通過回顧胰腺癌中醫治療的病因病機、試驗研究和臨床觀察，總結了近十年來多位臨床醫家的經驗，發現濕熱內蘊證、氣血瘀滯證和脾虛濕熱證為胰腺癌的常見證型。這一結果與我們臨床觀察基本相符合，故我們將胰腺癌病人大致分為這三種證型。

近期大量論文和綜述涵蓋了包括肥胖、糖尿病、炎癥性腸病、肝病、心臟代謝紊亂、神經退行性疾病及癌癥在內的疾病，都存在著腸道微生物群的變化[8-13]。本研究的胰腺癌三種不同中醫證型中，脾虛濕熱組中的纖毛菌屬（Leptotrichia）、彎曲桿菌屬（Campylobacter）、奇異菌屬（Atopobium）、顆粒鏈菌屬（Granulicatella）以及鏈球菌屬（Streptococcus）的相對豐度較高（屬于脾虛濕熱組的差異物種），而在濕熱內蘊組中的相對豐度則最低（除彎曲桿菌屬外）。Ren等[14]首次通過MiSeq 測序方法分析了中國胰腺癌患者的腸道微生物結構特征，結果發現與健康對照組相比，彎曲桿菌屬（Campylobacter）和纖毛菌屬（Leptotrichia）在胰腺癌患者的糞便微生物中顯著富集。此外，比較胰頭癌伴膽總管阻塞患者組和胰頭癌不伴有膽總管阻塞患者組的腸道微生物發現，胰頭癌患者組較胰體胰尾癌患者組的鏈球菌屬（Streptococcus）豐度顯著增加，提示了鏈球菌屬（Streptococcus）與腸道中的膽汁酸和脂質穩態有關。胰腺癌腸道菌群結構特征尚未見更多報道。然而，口腔微生物群與消化道微生物群重疊，并可通過循環轉移至胰腺[15]。有學者使用16S rDNA 測序技術來研究胰頭癌患者的舌苔微生物群結構特征發現，胰頭癌患者的舌苔菌群多樣性顯著增加，主成分分析顯示患者的舌苔菌群組成與健康人具有顯著性差異，其中纖毛菌屬（Leptotrichia）、奇異菌屬（Atopobium）、彎曲桿菌屬（Campylobacter）等13 個菌屬在胰頭癌患者的舌苔菌群中顯著增加[16]。James Farrell 等[17]將胰腺癌患者組和健康對照組的唾液微生物群進行綜合比較，發現與所有非癌癥受試者相比，胰腺癌患者的顆粒鏈菌屬（Granulicatella）中的Granulicatella adiacens 水平顯著升高，流行病學研究表明口腔炎癥（牙周炎）與胰腺癌發展的風險增加呈正相關[18]。鏈球菌屬（Streptococcus）的牛鏈球菌（Streptococcus bovis）、溶血鏈球菌（Streptococcus gallolyticus subsp.）和巴氏桿菌（Pasteurianus）引起的菌血癥和胰腺癌之間有關聯，但仍有待進一步的研究[19-20]。其余的菌屬暫未發現與胰腺癌發生發展的特異性和顯著相關性。

表2 差異顯著物及其豐度均值列表

腸道微生態也是一個陰陽平衡的整體。腸道菌群可以分為對人體有益的細菌和有害的細菌，在正常情況下，人體內兩者處于相對平衡的狀態，若兩者比例失調則會導致腸道微生態的紊亂從而致病。從中醫學角度來看，濕熱內蘊證以濕熱之邪實為主要矛盾，體內正氣并未虧虛，正氣尚能抵御外邪之擾，故而體內腸道的腸道微生態尚能維持相對平衡，此證型與健康人群腸道微生態結構最為接近（韋恩圖中交集最多）。而脾虛濕熱證患者雖有濕熱之表象，但其病機的根本卻是久病或攻伐消癥后中焦脾胃之氣漸耗，以體內正氣虛衰為主要矛盾，正虛則無以抵抗外邪，故而體內腸道的腸道微生態出現失衡，與健康人群腸道微生態結構差異較大（韋恩圖中交集最少）。胰腺癌三種中醫證型中，脾虛濕熱組中纖毛菌屬（Leptotrichia）、彎曲桿菌屬（Camphlobacter）、奇異菌屬（Atopobium）、顆粒鏈菌屬（Granulicatella）以及鏈球菌屬（Streptococcus）的豐度較高，其預后較差；而濕熱內蘊組中的豐度最低（除彎曲桿菌屬外），其預后較好。

本文研究顯示，胰腺癌不同中醫證型的腸道菌群結構差異及其預后具有一定的相關性。然而，腸道微生態是一個十分復雜的系統，飲食習慣、藥物治療、大便頻率和規律等因素都是影響微生物群組成的因素，應予以考慮。所產生的改變也需要系統的、復雜的評價方法。此外，本研究存在樣本量過小、分組不均衡、截尾樣本率偏高等問題，后續研究需要進一步完善。