2種中國櫻桃果實有機酸積累及代謝相關酶活性的研究

李 航，陶海青，陳益香，龔成宇，楊 科，龔榮高

(四川農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，成都 611130)

中國櫻桃(CerasuspseudocerasusLindl.)隸屬薔薇科李亞科櫻屬，起源于中國，有著3000余年的栽培歷史[1]，是世界四大櫻桃栽培種之一[2]，果實營養(yǎng)豐富，富含磷、鐵、維生素C和胡蘿卜素等[3-4]，一直深受消費者的喜愛。己有的研究表明，果實中的有機酸種類、質量分數(shù)及其構成比例和形成動態(tài)是果實風味形成的重要基礎[5]，果實中有機酸組分很多，但大多數(shù)果實通常以1種或2種有機酸為主，其他僅以少量或微量存在。有機酸質量分數(shù)與果實的酸度有顯著的相關性，不僅對平衡果實的風味非常重要[6]，而且在果實的光合作用，呼吸作用，以及成酚類、酯類和氨基酸的合成中發(fā)揮重要作用[7]。果實中有機酸的合成代謝途徑受代謝相關酶活性的調控(代謝途徑見圖1)[8-11]，其中調控蘋果酸代謝的酶主要包括蘋果酸脫氫酶(NAD-MDH)、蘋果酸酶(NADP-ME)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)。PEPC主要催化PEP生成OAA以及無機磷[12]，NAD-MDH能夠將OAA氧化成蘋果酸，從而快速降低OAA的質量分數(shù)[13]；NADP-ME主要催化蘋果酸生成丙酮酸，對蘋果酸的降解起到催化作用，在成熟蘋果果實里的NADP-ME活性的增加能夠減少有機酸的質量分數(shù)[14]；而檸檬酸合成酶(CS)主要催化OAA和Ac-CoA縮合產(chǎn)生檸檬酸。中國櫻桃果實具有很高的食用價值，但目前果實有機酸質量分數(shù)偏高是中國櫻桃產(chǎn)業(yè)的問題之一，研究中國櫻桃果實有機酸代謝對于中國櫻桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有重大的理論和實踐意義，而且對于中國櫻桃果實中有機酸代謝機制的研究也相對較少。因此，本試驗以‘黑櫻桃’和‘紅櫻桃’2種中國櫻桃為材料，測定中國櫻桃果實發(fā)育過程中有機酸組分及質量分數(shù)、相關酶活性，探討中國櫻桃果實發(fā)育過程中有機酸積累的機理，為進一步研究果實有機酸代謝提供理論依據(jù)，同時為中國櫻桃生產(chǎn)栽培、品種選育、提高中國櫻桃果實品質提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

取樣地位于四川省雅安市漢源縣，屬亞熱帶季風性氣候，冬暖夏涼，四季分明。年平均氣溫17.9 ℃，無霜期300 d，年平均日照時間1 475.8 h，年活動積溫5 844.7 ℃，年均降雨量741.8 mm。

以漢源縣當?shù)卦耘嗟摹跈烟摇汀t櫻桃’為試材，每種試材選擇樹勢中庸、生長健壯、長勢相近的10 a生植株5株作為供試植株，采用常規(guī)管理。盛花期開始，從每株供試植株中選擇大小基本一致，具有代表性的花序掛牌標記。

圖1 果實細胞有機酸代謝途徑Fig.1 Organic acid metabolism in fruit cell

1.2 取樣方法

在盛花后6、12、18、24、30、36、42 d取樣。在10株供試植株樹冠外圍1～2 m處取樣，每株選擇無病蟲害、中等大小的果實40個，用冰盒帶回實驗室，用液氮速凍分裝后于-80 ℃超低溫冰箱中保存。

1.3 果實生長發(fā)育動態(tài)測定

果實單果質量用萬分之一天平測定，縱橫徑用數(shù)顯游標卡尺測定。

1.4 有機酸質量分數(shù)測定

蘋果酸、酒石酸、奎寧酸和檸檬酸的質量分數(shù)采用高效液相色譜法(HPLC)測定，提取和測定方法參考馬倩倩等[15]和張麗麗等[16]的方法并略加改進。使用Agilent高效液相色譜儀(Agilent 1260Ⅱ)測定，色譜柱為C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為0.04 mol·L-1KH2PO4，柱溫為30 ℃，紫外檢測器，檢測波長210 nm，流速 0.5 mL·min-1，進樣量10 μL。

1.5 蔗糖代謝相關酶活性測定

酶液的制備，蘋果酸脫氫酶(NAD-MDH)、蘋果酸酶(NADP-ME)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)和檸檬酸合成酶(CS)活性的測定參考龔榮高等[17]和李甲明等[18]的方法，并略加改進。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010和SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)處理。

2 結果與分析

2.1 2種中國櫻桃單果質量變化

由圖2可見，2種中國櫻桃果實發(fā)育持續(xù)時間在42 d左右，2種櫻桃果實發(fā)育呈慢—快的生長趨勢，在花后6～24 d(幼果期)單果質量增長速率較慢；花后30 d后果實進入轉色膨大期，果實單果質量迅速增加，推測此時期為2種中國櫻桃果實發(fā)育的關鍵時期；整個發(fā)育過程中‘紅櫻桃’單果質量明顯高于‘黑櫻桃’，成熟時‘黑櫻桃’單果質量為2.72±0.11 g，‘紅櫻桃’單果質量為 3.74±0.17 g。

2.2 2種中國櫻桃縱橫徑變化

由圖3可見，在果實發(fā)育前期(花后6～ 24 d)，中國櫻桃果實縱徑大于橫徑，縱徑橫徑緩慢上升；從花后30 d開始果實橫徑迅速上升，并明顯高于橫徑，橫徑變化較為平穩(wěn)。成熟時‘黑櫻桃’縱徑1.70±0.085 cm，橫徑1.87±0.086 cm，果形指數(shù)為0.92；‘紅櫻桃’縱徑1.66±0.084 cm，橫徑2.02±0.089 cm，果形指數(shù)為0.82。果實成熟時，‘黑櫻桃’果實指數(shù)高于‘紅櫻桃’，使得‘紅櫻桃’比‘黑櫻桃’果形更偏扁圓形，也與成熟時‘紅櫻桃’果實單果質量大于‘黑櫻桃’相一致。

2.3 2種中國櫻桃果實有機酸質量分數(shù)變化

由圖4可見，在整個發(fā)育時期，2種中國櫻桃成熟果實中有機酸以蘋果酸為主，蘋果酸和酒石酸質量分數(shù)變化趨勢和總酸質量分數(shù)變化相近，總體呈先上升后降低的變化趨勢，花后13 d開始，果實蘋果酸和總酸質量分數(shù)開始迅速上升，在花后30 d質量分數(shù)上升到最高，花后30 d開始逐漸降低。發(fā)育期內，‘黑櫻桃’奎寧酸質量分數(shù)變化不大，‘紅櫻桃’奎寧酸質量分數(shù)從花后30 d開始呈降低的趨勢；2種中國櫻桃果實檸檬酸質量分數(shù)呈升高—降低—升高—降低的變化趨勢，在花后24 d檸檬酸質量分數(shù)最低，花后30 d質量分數(shù)最高，花后30 d開始降低。

圖2 櫻桃果實發(fā)育過程單果質量變化Fig.2 Changes of fruit mass during cherry fruit development

a.黑櫻桃 Heiyingtao；b.紅櫻桃 Hongyingtao

花后42 d果實成熟時‘黑櫻桃’蘋果酸質量分數(shù)為4.62±0.15 mg·g-1，占總酸質量分數(shù)的89%；‘紅櫻桃’蘋果酸質量分數(shù)為5.50±0.11 mg·g-1，占總酸質量分數(shù)的85%。奎寧酸和檸檬酸質量分數(shù)相近，‘黑櫻桃’奎寧酸和檸檬酸占總酸質量分數(shù)的5%和4%，‘紅櫻桃’奎寧酸和檸檬酸占總酸質量分數(shù)的9%和4%；酒石酸質量分數(shù)最低，占總酸質量分數(shù)的1%。‘紅櫻桃’成熟果實中各有機酸質量分數(shù)均高于‘黑櫻桃’。

2.4 2種中國櫻桃果實中有機酸代謝相關酶活性變化

2.4.1 蘋果酸脫氫酶活性 由圖5可以看出， 2種中國櫻桃果實蘋果酸脫氫酶(NAD-MDH)活性總體呈先升高再降低趨勢，與蘋果酸變化趨勢相近，在花后12～30 d NAD-MDH 活性呈上升趨勢，在花后30 d活性達到最高，‘黑櫻桃’為 12.39±0.62 U·g-1·min-1，高于‘紅櫻桃’的 11.39±0.41 U·g-1·min-1。花后30 d后NAD-MDH活性迅速下降，成熟時‘黑櫻桃’果實中NAD-MDH的活性最低，為3.85±0.21 U·g-1·min-1，‘紅櫻桃’為4.77±0.55 U·g-1·min-1，‘紅櫻桃’果實中NAD-MDH活性高于‘黑櫻桃’。兩者相比較而言，花后12 d前‘紅櫻桃’NAD-MDH活性有小幅度降低；‘黑櫻桃’NAD-MDH活性在花后12～30 d期間高于‘紅櫻桃’，花后30 d后，‘黑櫻桃’該酶降低幅度大于‘紅櫻桃’，‘紅櫻桃’該酶活性更高。

圖4 櫻桃果實發(fā)育過程酸組份質量分數(shù)變化Fig.4 Changes in acid mass fraction during the development of cherry fruit

圖5 櫻桃果實發(fā)育過程蘋果酸脫氫酶活性變化Fig.5 Changes in NAD-MDH activity during the development of cherry fruit

2.4.2 蘋果酸酶活性 由圖6可以看出，2種櫻桃果實發(fā)育過程中蘋果酸酶(NADP-ME)活性總體呈先下降再上升的趨勢；花后30 d前NADP-ME活性持續(xù)下降且變化較為平穩(wěn)，在花后30 d下降到最低值，‘黑櫻桃’最低為0.04±0.02 U·g-1·min-1，‘紅櫻桃’最低為0.09±0.05 U·g-1·min-1；花后30 d后，2種櫻桃NADP-ME活性迅速上升，成熟時該酶活性到達最高，‘黑櫻桃’最高為1.12±0.07 U·g-1·min-1，‘紅櫻桃’最高為0.78±0.05 U·g-1·min-1。兩者相比較，花后24 d前NADP-ME活性變化趨勢相反，花后24 d后變化趨勢相同，從花后30 d開始，‘黑櫻桃’NADP-ME活性一直高于‘紅櫻桃’。

圖6 櫻桃果實發(fā)育過程蘋果酸酶活性變化Fig.6 Changes in NADP-ME activity during the development of cherry fruit

2.4.3 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性 由圖7可以看出，2種櫻桃果實磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)活性總體呈先升高再降低趨勢，在花后24 d前PEPC活性上升且變化平穩(wěn)，花后24～ 30 d迅速上升并到達峰值，‘黑櫻桃’最高為0.96±0.03 U·g-1·min-1，‘紅櫻桃’為0.99±0.05 U·g-1·min-1。果實發(fā)育后期(花后30～ 42 d)，2種櫻桃果實PEPC活性迅速下降，果實成熟時降至最低，‘黑櫻桃’最低為0.32±0.05 U·g-1·min-1，‘紅櫻桃’為0.31±0.04 U·g-1·min-1。2種櫻桃相比較，‘黑櫻桃’果實PEPC活性在整個發(fā)育期內都高于‘紅櫻桃’。

圖7 櫻桃果實發(fā)育過程磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性變化Fig.7 Changes in PEPC activity during the development of cherry fruit

2.4.4 檸檬酸合成酶活性 圖8顯示，‘黑櫻桃’果實CS活性整體呈下降趨勢，‘紅櫻桃’CS活性整體呈上升趨勢；2種櫻桃果實CS活性在發(fā)育前期(花后6～18 d)變化平穩(wěn)，花后24 d CS活性迅速降低后，在花后30 d迅速上升至峰值，‘黑櫻桃’最高為0.18±0.004 U·g-1·min-1，‘紅櫻桃’為0.21±0.01 U·g-1·min-1。果實發(fā)育后期(花后30～42 d)，2種櫻桃CS活性迅速下降至果實成熟，成熟時‘黑櫻桃’果實CS活性為 0.10±0.01 U·g-1·min-1，‘紅櫻桃’為 0.16±0.002 U·g-1·min-1。兩者相比較，從花后 12 d開始，‘紅櫻桃’CS活性一直高于‘黑 櫻桃’。

圖8 櫻桃果實發(fā)育過程檸檬酸合成酶活性變化Fig.8 Changes in citrate synthetase (CS) activity during the development of cherry fruit

2.5 中國櫻桃果實中酸質量分數(shù)與相關酶活性相關性

由表1可以看出，在果實發(fā)育期內，‘黑櫻桃’果實蘋果酸和總酸質量分數(shù)也與蘋果酸脫氫酶(NAD-MDH)活性呈極顯著正相關(R2= 0.886**,R2=0.892**)，與蘋果酸酶(NADP-ME)和檸檬酸合成酶(CS)活性呈負相關，蘋果酸、酒石酸和總酸質量分數(shù)與磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)活性呈極顯著正相關(R2= 0.918**,R2=0.907**,R2=0.914**)，酒石酸質量分數(shù)與蘋果酸酶(NADP-ME) 活性呈極顯著負相關(R2=-0.886**)；‘紅櫻桃’果實蘋果酸和總酸質量分數(shù)與蘋果酸脫氫酶(NAD-MDH)活性呈顯著正相關(R2=0.801*,R2= 0.788*)，與磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)活性呈顯著正相關(R2=0.855*,R2=0.855*)，與蘋果酸酶(NADP-ME)活性呈負相關，檸檬酸質量分數(shù)與檸檬酸合成酶(CS)活性呈正相關。由此可知，NAD-MDH、PEPC在櫻桃果實有機酸積累過程中起到關鍵作用。

表1 中國櫻桃果實有機酸質量分數(shù)與代謝相關酶的相關性分析Table 1 Correlation analysis between organic acid mass fraction and metabolic related enzymes in Chinese cherry fruit

注：** 代表極顯著性相關(P<0.01)；*代表顯著性相關(P<0.05)。

Note：** means highly significant correlation(P<0.01); * means significant correlation (P<0.05).

3 討 論

許多果實中主要有機酸在果實發(fā)育過程中呈現(xiàn)前期上升后期下降的變化趨勢[19]，如砂梨[20]、石榴[21]和杏[22]等。本試驗中，2種中國櫻桃果實有機酸積累以蘋果酸為主，成熟時果實中蘋果酸質量分數(shù)占總酸質量分數(shù)85%以上，而其他有機酸質量分數(shù)很低，屬于蘋果酸型果實，與甜櫻桃[23]、蘋果[24]和枇杷[25]上的研究結果相似。成熟時‘黑櫻桃’果實較低的有機酸質量分數(shù)決定了其風味相對于‘紅櫻桃’的優(yōu)勢。

雖然有機酸質量分數(shù)過高會導致果實風味變差，但在果實生長發(fā)育中占據(jù)重要作用，有機酸的積累受到有機酸代謝相關酶調控。本試驗中，NAD-MDH和PEPC活性與蘋果酸質量分數(shù)變化趨勢大致相同，呈顯著正相關，2種中國櫻桃蘋果酸積累的差異主要與2種酶活性高低有關。櫻桃果實中NADP-ME活性與蘋果酸質量分數(shù)變化趨勢相反，呈負相關，2種中國櫻桃果實進入轉色期后蘋果酸質量分數(shù)下降與NADP-ME活性迅速升高有關，果實成熟時，NADP-ME活性升高使得蘋果酸開始分解，造成蘋果酸質量分數(shù)下降，而2種中國櫻桃果實發(fā)育后期NADP-ME活性的差異也是導致成熟時蘋果酸質量分數(shù)差異的原因，與在桃、果梅和蘋果等果實中NAD-MDH和PEPC調控蘋果酸的合成，NADP-ME調控蘋果酸分解的結果相一致[23-25]。本試驗中，2種中國櫻桃果實中CS活性較低，更多的OAA在NAD-MDH作用下合成蘋果酸，導致檸檬酸在果實中質量分數(shù)低，但相關性分析表明2種櫻桃果實中CS活性都和檸檬酸顯著相關，CS是2種中國櫻桃調控檸檬酸合成的關鍵酶，與郭潤姿等[26]在蘋果酸積累型果實黃冠梨中發(fā)現(xiàn)檸檬酸的積累與CS活性呈極顯著正相關的結果相似。在2種中國櫻桃果實發(fā)育的不同時期，果實有機酸積累和酸代謝酶的活性均不相同，有機酸的積累可能是多種酸代謝酶相互作用的結果，并通過影響果實內有機酸的積累，進而影響果實的風味，決定果實的品質。

4 結 論

‘黑櫻桃’和‘紅櫻桃’2種中國櫻桃果實有機酸以蘋果酸，檸檬酸和奎寧酸為主，其中蘋果酸質量分數(shù)遠高于其他有機酸，在發(fā)育期內呈先升高后降低的變化趨勢，成熟時‘黑櫻桃’果實有機酸質量分數(shù)低于‘紅櫻桃’。花后30 d進入轉色期為2種中國櫻桃果實發(fā)育的關鍵時期，進入轉色期后果實有機酸質量分數(shù)開始迅速降低。NAD-MDH、PEPC和NADP-ME是2種中國櫻桃蘋果酸代謝的關鍵酶，果實中有機酸積累不僅是各種酸代謝酶共同調控、相互作用影響有機酸的組分和質量分數(shù)，還可能與其他因素有關。