新疆馬鈴薯鐮刀菌根腐病發生危害調查及病原菌鑒定

楊 波，郭成瑾，王喜剛，沈瑞清,

(1.寧夏大學 農學院，銀川 750021；2.寧夏農林科學院植物保護研究所，銀川 750002)

馬鈴薯是繼水稻、小麥和玉米之后的第四大糧食作物[1]，糧蔬飼兼用，具有很高的營養、藥用和經濟價值[2-3]。新疆是中國馬鈴薯產區之一，因馬鈴薯性喜冷涼、耐旱、耐貧瘠、高產、適應性強等特點，近年來，新疆馬鈴薯的種植面積大幅增加[4]。據報道，馬鈴薯各種病害的發生及危害也逐年加重，其中真菌性病害發生最重[5-7]，鐮刀菌引起的根腐病作為真菌性病害中的一種，在馬鈴薯的生長期及儲藏期均有發生，不僅制約馬鈴薯的產量，而且影響馬鈴薯儲藏期的品質，是限制新疆馬鈴薯產業發展的重要因素。

鐮刀菌(Fusariumssp.)是世界范圍內分布的一類真菌，寄主范圍廣，侵染能力強，可侵染植物的根、莖、穗和果實，引起植物的根腐、莖腐等多種病害[8-9]。本研究中馬鈴薯鐮刀菌根腐病是由鐮刀菌引起的馬鈴薯根、莖及薯塊發病的病害總稱，其中由鐮刀菌引起的馬鈴薯儲藏期病害稱為干腐病，鐮刀菌干腐病是馬鈴薯儲藏期危害最嚴重的病害之一[10]，可使儲藏期的馬鈴薯平均減產6%～25%[11]，產量損失最高可達60%[12]。鐮刀菌侵染馬鈴薯塊莖，通常表現為薯塊顏色發暗、褐變、內部常呈空心[13]，從具有典型發病癥狀的塊莖上分離最多的鐮刀菌為茄病鐮刀菌(F.solani)、尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)、燕麥鐮刀菌(F.avenaceum)、黃色鐮刀菌(F.culmorum)、接骨木鐮刀菌(F.sambucinum)、半裸鐮刀菌 (F.semitectum)[14-15]。不同地區引起馬鈴薯鐮刀菌干腐病的種類有一定差異，據報道，在北美和部分歐洲國家，接骨木鐮刀菌和藍色鐮刀菌(F.coeruleum)被認為是引起馬鈴薯干腐病最主要的病原菌[16-17]；而由茄病鐮刀菌引起的馬鈴薯干腐病在伊朗和南非發生嚴重[18]；在中國河北和內蒙古共分離到4種致病鐮刀菌，其中銳頂鐮刀菌(F.acuminatum)是優勢分離菌[19-20]；李金花等[21]在對甘肅馬鈴薯鐮刀菌干腐病的優勢病原菌研究中發現，接骨木鐮刀菌和茄病鐮刀菌是優勢分離種；引起黑龍江省馬鈴薯干腐病的鐮刀菌有6種，閔凡祥等[22]在對鑒定出的鐮刀菌進行致病性測試中發現，接骨木鐮刀菌、燕麥鐮刀菌和擬絲孢鐮刀菌(F.trichothecioides)的致病力最強，擬枝孢鐮刀菌(F.sporotrichioides)最弱。

本試驗對新疆馬鈴薯鐮刀菌根腐病進行調查和取樣，將病樣進行病原菌的分離純化，通過形態學和分子生物學對其進行種類鑒定，并對鑒定出的鐮刀菌進行致病性測定，確定引起新疆地區馬鈴薯鐮刀菌根腐病的主要致病菌，為防治馬鈴薯根腐病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato dextrose agar，PDA)培養基:馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂12 g、蒸餾水1 000 mL；Joff修改的Bilai’s培養基：磷酸二氫鉀1 g、硝酸鉀1 g、氯化鉀 0.5 g、七水硫酸鎂0.5 g、淀粉0.2 g、葡萄糖0.2 g、瓊脂12 g、蒸餾水1 000 mL；麥麩培養基：麥麩500 g、蒸餾水20 mL。

主要試劑及儀器：DNA提取試劑盒(杭州博日科技有限公司)、2×EasyTaqPCR SuperMix、Trans 2K DNA Marker、Gelstain、ddH2O(北京全式金生物技術有限公司)、50×TAE電泳緩沖液(北京索萊寶科技有限公司)等。SPX-250生化培養箱(上海躍進醫療器械有限公司)、T100TMThermalCycler PCR儀(時代聯想生物科技有限公司)、DYY-6C型電泳儀(北京六一生物科技有限公司)、Azure Biosystems C200凝膠成像系統(北京深藍云生物科技有限公司)、高速冷凍離心機(上海安亭科學儀器廠)、LE204E/02電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)、TOMY SX-500高壓滅菌器(上海麥森醫療科技有限公司)等。

1.2 馬鈴薯鐮刀菌根腐病田間發病情況調查

2016-2017年在新疆馬鈴薯種植區，采用隨機取樣的方法對鐮刀菌根腐病進行調查，本試驗主要研究由鐮刀菌引起的田間馬鈴薯塊莖、根莖腐類病害，因此在調查取樣中只側重于表現為該病害癥狀的病樣，在每個馬鈴薯種植區調查20株，通過觀察莖基部、根及塊莖上有無病斑及病斑的大小，確定鐮刀菌根腐病發生的嚴重度，并計算病害發生率，將具有典型癥狀的根莖等帶回實驗室，保存于4 ℃冰箱中，用于病原菌的分離。

病害發生率=(發病株數/調查株數)×100%。

1.3 病原菌的分離、鑒定

1.3.1 病原菌分離純化 用常規組織分離法對采集的病害樣本進行分離[23]，利用單孢分離法對分離到的菌株進行純化。單孢分離采用稀釋平板法，刮取少許菌絲于盛有無菌水的1.5 mL離心管中混勻制成孢子懸浮液，取一滴在顯微鏡下進行觀察，如若一個鏡頭下只有0～1個孢子，則取一滴該濃度下的孢子懸浮液滴于PDA培養基上，用涂布玻璃棒將其均勻涂開，待單孢長出菌絲，挑取菌絲轉至新的PDA培養基上25 ℃恒溫培養。

1.3.2 病原菌形態特征觀察 將單孢菌株純化后轉接于PDA培養基和Bilai’s培養基上，觀察菌落顏色、形狀及菌絲的疏密情況，測定菌落生長4 d時的菌落直徑。產孢后，在顯微鏡下觀察分生孢子的大小、形狀、數量，及產孢細胞的形狀，厚垣孢子的有無及形狀。根據病原菌的形態特征，依據Booth分類系統[24]，同時參考《山西鐮刀菌》[25]等相關資料進行形態學鑒定。

1.3.3 基因組DNA提取 病原菌DNA采用Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒提取。首先將培養好的鐮刀菌菌絲于研缽中液氮冷凍后研磨，根據試劑盒提供的方法步驟進行操作。取 5 μL DNA溶液在15 g/L瓊脂糖凝膠上電泳，DNA于-20 ℃保存，備用。

1.3.4 病原菌基因序列擴增及測序 采用鐮刀菌屬特異性引物EF-1H/EF-2T對分離到的鐮刀菌進行分子鑒定。EF-1H：5′-ATGGGTAAGGAAGACAAGAC-3′，EF-2T：5′-GGAAGTACCAGTGATCATGTT-3′[26]。

對所提DNA進行PCR擴增，每個反應體系總體積為25 μL，其中模板DNA 1 μL (56 ng/μL)，上下游引物各1 μL(1 μmol/L)，2×EasyTaqPCR Super Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。

PCR擴增程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃延伸5 min。將PCR產物送往上海生工生物工程有限公司進行測序。

1.3.5 序列數據處理及系統發育樹構建 對測序結果在NCBI網站進行BLAST比對，根據比對結果從GenBank數據庫獲得最相似的序列，進行同源性比較，利用MEGA 5.20分析軟件采用NJ法構建基于EF-1α基因序列的系統發育樹，分析所分離菌株與其他菌株間的親緣關系，確定分類地位。

1.4 病原菌致病性測定

根據柯赫氏法則對病原菌致病性進行驗證[23]。分別取編號為X9-1-1、X29-1-1、X16-2-2、X16-1-3和X8-2-1的菌株進行致病性測定，將5株鐮刀菌接入PDA平板培養基上培養7～10 d后，用直徑10 mm的打孔器取菌餅10片，接于裝有麥麩培養基的三角瓶中，25 ℃下培養9～15 d，待菌絲長滿培養基后，以1∶100(質量比)比例與滅菌土混勻分別制成菌土[27]。播種馬鈴薯(品種‘青薯9號’)于裝有菌土的花盆中，以裝有無菌土的花盆為對照，每種處理3次重復，每個重復播種3株，置于溫室中培養。待植株發病后觀察發病情況并統計發病率，同時，采用組織分離法對病原菌進行再分離，將分離物的菌落形態、孢子形態等與接種菌株進行比較。

1.5 數據處理與分析

用Excel 2003軟件進行數據整理及作圖，用MEGA 5.20分析軟件對基因序列進行系統發育樹的構建。

2 結果與分析

2.1 馬鈴薯鐮刀菌根腐病田間發病情況

2.1.1 田間癥狀 調查發現，新疆地區馬鈴薯鐮刀菌根腐病的危害期主要為出苗期和結薯期。該病害主要危害馬鈴薯的根莖部位，在馬鈴薯儲藏期也會危害薯塊，稱為馬鈴薯干腐病，均是由鐮刀菌屬真菌引起的病害。危害癥狀主要表現為根部腐爛，根基部常常縊縮，維管束褐變，莖基部出現黑褐色不規則斑塊，濕度大時往往會產生白色的霉層。地上部分主要表現為植株瘦弱矮小，葉片開始枯黃萎蔫。

2.1.2 田間發生情況 對新疆15個馬鈴薯種植區進行病害調查發現，不同地區病害發生嚴重度和發生率不同。從病害發生嚴重度上看，十二師西山農場和尼勒克的鐮刀菌根腐病發生最嚴重，而烏魯木齊縣板房溝鄉等4個地區發生最輕。從病害發生率上看，伊寧縣病害發生率高達80%，是所有調查地區中病害發生最高的，其次發生率較高的是烏魯木齊縣永豐鄉和尼勒克，發生率為40%，病害發生率最低的是烏魯木齊縣板房溝鄉和呼圖壁縣呼圖壁鎮兩個地區，發生率為5%(表1)。

2.2 病原菌分離及形態學鑒定

2016-2017年，在新疆15個馬鈴薯產區采集具有典型鐮刀菌根腐病癥狀的病株/薯198份，組織分離獲得鐮刀菌菌株，采用單孢法純化分離到的菌株，共獲得純培養菌株322株。

通過對供試菌株在PDA及Bilai’s培養基上培養性狀的觀察及分生孢子的顯微觀察，對菌株進行初步的形態學鑒定，將其鑒定為5種鐮刀菌。形態學鑒定雖然可以將大部分菌株區分開來，但有些菌株變異較大，僅僅依靠形態學鑒定很難將其鑒定到種的水平，因此還要依靠分子生物學鑒定。鐮刀菌的形態學特征如下。

2.2.1 尖孢鐮刀菌 培養4 d的菌落直徑3.10 cm，菌絲白色，棉絮狀、多。小型分生孢子卵形，棍棒形或橢圓形，0～1分隔；大型分生孢子較直，中間略彎曲，頂胞尖，基胞足跟明顯，2～5分隔。單瓶梗產孢，產孢梗短，厚垣孢子橢圓形或球形，單個間生。

2.2.2 木賊鐮刀菌 培養4 d的菌落直徑5.00 cm，菌絲白色、黃褐色，棉絮狀，茂盛。小型分生孢子長橢圓形、腎形及棍棒形，0～1分隔，多數無隔；大型分生孢子鐮刀形，腹背稍彎曲，頂細胞漸尖，基胞足跟明顯。3～7分隔，多數5分隔。單瓶梗產孢，產孢梗較短，厚垣孢子球形，單個，間生或頂生。

2.2.3 芬芳鐮刀菌 培養4 d的菌落直徑4.40 cm，菌絲白色，羊毛狀或氈狀。小型分生孢子卵圓形，0～1分隔；大型分生孢子較直，頂細胞鈍，基胞足跟不明顯，2～5分隔。單瓶梗產孢，產孢梗較長，厚垣孢子未見。

2.2.4 茄病鐮刀菌 培養4 d的菌落直徑2.50 cm，菌絲少，白色，絨狀。小型分生孢子多，以橢圓形、腎形及卵形為主，0～1隔，多數1隔；大型分生孢子馬特形，兩端鈍，略彎曲，2～5分隔，多數3隔。單瓶梗產孢，產孢梗長，厚垣孢子球形，單生或串生于菌絲中間。

2.2.5 銳頂鐮刀菌 培養4 d的菌落直徑4.45 cm，菌絲淡黃色，羊毛狀，茂盛。小型分生孢子橢圓形、紡錘形及腎形，0～1分隔；大型分生孢子頂細胞延長，基胞足跟明顯，2～5分隔，多數3分隔。單瓶梗產孢，厚垣孢子球形，單個頂生或 間生。

2.3 分子生物學鑒定

通過EF-1H/EF-2T引物對分離到的菌株進行序列測定，獲得長度為711～748 bp的序列片段。將獲得的DNA序列與GenBank中已登錄鐮刀菌的序列進行同源性比較，并用MEGA 5.20分析軟件采用NJ法構建系統發育樹(圖1)。結果表明，編號為X8-2-1和X9-1-1的菌株與GenBank中登錄號為KX094920.1的銳頂鐮刀菌聚在一個分枝上，說明其親緣關系最近，且同源性達98%，菌株X8-2-1和X9-1-1的形態學鑒定均為銳頂鐮刀菌，與分子學鑒定結果一致。菌株X8-1-1和X16-2-2與登錄號為HQ702585.1的芬芳鐮刀菌聚在一起，同源性高達99%，與形態學鑒定結果一致，確定X8-1-1和X16-2-2菌株為芬芳鐮刀菌。編號為X19-1-1的菌株與登錄號為KJ647280.1和KU361443.1的尖孢鐮刀菌序列的同源性為99%，且與形態學鑒定結果相一致，說明這兩株菌株為尖孢鐮刀菌。分離編號為X16-1-3的菌株與GenBank中登錄號為KX901848.1的茄病鐮刀菌的同源性為99%，與菌株X16-1-3的形態學鑒定結果一致，確定其為茄病鐮刀菌。編號為X29-1-1的菌株與登錄號為KP400714.1的木賊鐮刀菌的同源性為99%，聚在一個分枝上，且與形態學鑒定結果一致，確定該菌株為木賊鐮刀菌。通過對新疆分離到的鐮刀菌菌株進行EF-1α基因序列分析，以及形態學鑒定，確定引起新疆馬鈴薯鐮刀菌根腐病的病原菌依次為尖孢鐮刀菌、茄病鐮刀菌、銳頂鐮刀菌、芬芳鐮刀菌和木賊鐮刀菌。

表1 新疆各地區馬鈴薯鐮刀菌根腐病調查結果Table 1 Investigation of potato Fusarium root rot disease in Xinjiang

注：“+”表示發病的輕重程度，“+”發病輕、“++”發病中、“+++”發病重。

Note:“+” indicates the severity of the disease, “+” is light, “++” is medium, and “+++” is heavy.

2.4 鐮刀菌種類及分離頻率

對新疆15個馬鈴薯產區病害樣本采集及分離得到的322株菌株進行形態學和分子生物學鑒定，結合兩種鑒定方法將其鑒定為5種鐮刀菌(圖2)，其中木賊鐮刀菌共分離到18株，分離頻率為5.59%；茄病鐮刀菌共分離到28株，分離頻率為8.70%；銳頂鐮刀菌分離到55株，分離頻率為17.08%；芬芳鐮刀菌分離到55株，分離頻率為17.08%；尖孢鐮刀菌分離到166株，分離頻率為51.55%。從鐮刀菌分離頻率上看，尖孢鐮刀菌為新疆地區優勢分離菌種，相對于尖孢鐮刀菌來說，木賊鐮刀菌和茄病鐮刀菌的分離頻率非常低。

圖1 基于 EF-1α序列構建的馬鈴薯鐮刀菌根腐病菌系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree of potato root rot Fusarium based on EF-1α sequence

圖2 鐮刀菌的種類及分離頻率Fig.2 Species and isolation frequency of Fusarium

2.5 病原菌致病性測定

室內接種試驗結果表明，對照中馬鈴薯幼苗(圖3-a)的生長指標明顯優于接種的馬鈴薯幼苗(圖3-d)，接種后的薯苗生長受到抑制，植株矮小，葉片開始泛黃；發病植株須根開始從根尖褐變腐爛(圖3-c)，須根少(圖3-e)，根莖處縊縮變褐(圖3-b)，莖基部出現黑褐色病斑，與采樣得到的病株癥狀相似，而對照中馬鈴薯幼苗均未發病，生長良好，須根多，根莖部健康(圖3-f)。依據柯赫氏法則，從接種發病馬鈴薯幼苗的病健交界處按照“材料與方法”中病原菌分離鑒定描述的方法重新分離、純化和鑒定，得到的鐮刀菌菌株與接種所用菌株形態一致，證明所接菌株為馬鈴薯鐮刀菌根腐病的病原菌。

接種不同鐮刀菌的馬鈴薯植株發病率各不相同，統計分析結果顯示，發病率由高到低依次為：X16-1-3(F.solani)88.9%，X16-2-2(F.redolens)66.7%，X9-1-1(F.oxysporum)、X29-1-1(F.equiseti)、X8-2-1(F.acuminatum)均為 33.3%，說明在鑒定出的5種鐮刀菌中，茄病鐮刀菌和芬芳鐮刀菌的致病力較強，其余3個致病力 較弱。

a和f.健康植株(對照) Healthy plant (CK)；b、c、d、e.接種菌株X16-1-3引起的病害癥狀 Inoculated symptoms of disease caused by isolate X16-1-3

圖3 病原鐮刀菌致病性測定
Fig.3 Pathogenicity identification of potato root rot

3 結論與討論

隨著馬鈴薯主糧化戰略的提出[28]，馬鈴薯產業在農業發展中越來越重要，不僅能夠帶給農民經濟效益，而且在某些地區肩負著脫貧攻堅的重要使命。作為馬鈴薯種植產區之一的新疆，馬鈴薯產業也正朝著規模化方向發展，而馬鈴薯鐮刀菌根腐病的發生是制約馬鈴薯產業發展的關鍵因素。本研究通過對新疆地區馬鈴薯根腐病進行調查，結果表明馬鈴薯根腐病在調查的15個地區均有發生，其病害發生嚴重度和發生率有所不同，在所調查的地區中病害發生率最高的是伊寧縣，發生率高達80%；從病害發生的嚴重度上看，十二師西山農場和尼勒克的發病嚴重度最高。新疆地處中國最西邊，由于日照和熱量條件充足，非常適宜馬鈴薯的種植，隨著馬鈴薯在新疆的種植面積不斷加大，病害的發生也越來越嚴重，通過上述調查發現，新疆地區的伊寧縣、奇臺縣等地的病害發生率和嚴重度非常高，由于這些地方的種植戶在種植馬鈴薯時，習慣采用種植自留種薯和外調種薯，造成馬鈴薯的病毒感染，加大了土傳病害的發生率，加上天山豐沛的降水，使得馬鈴薯鐮刀菌根腐病的發生也逐年加重。

鐮刀菌是引起植物真菌類病害中最重要的病原菌，能夠引起多種植物的根腐病[29]，馬鈴薯枯萎病和干腐病也是由鐮刀菌的許多種引起的[30-31]，本文所指鐮刀菌根腐病也包括由鐮刀菌引起的馬鈴薯干腐病。據報道，中國大多數馬鈴薯種植地區都有鐮刀菌根腐病的發生。李金花等[21]和何蘇琴等[32]對甘肅不同地區引起馬鈴薯干腐病的病原菌進行分離鑒定，發現不同地區引起該病害的病原菌種類存在差異，優勢病原菌也不同。陳彥云[33]對寧夏西吉地區儲藏期的馬鈴薯進行病害調查，結果發現，引起西吉馬鈴薯干腐病的病原菌主要是茄病鐮刀菌和接骨木鐮刀菌。王麗麗等[7]對新疆烏昌地區窖藏馬鈴薯病害調查中發現，5種鐮刀菌可以引起馬鈴薯儲藏期鐮刀菌病害，分別為銳頂鐮刀菌、茄病鐮刀菌、黃色鐮刀菌、接骨木鐮刀菌和半裸鐮刀菌，而在本研究中發現引起新疆地區的病原菌主要為茄病鐮刀菌、銳頂鐮刀菌、芬芳鐮刀菌、木賊鐮刀菌和尖孢鐮刀菌，由于采集地點不同，所以在病原菌種類上存在一定差異，說明新疆地區引起馬鈴薯鐮刀菌根腐病的病原菌在地理位置分布上有明顯的地域差異。而在中國其他地方，對馬鈴薯鐮刀菌根腐病的研究主要集中在黑龍江[22]、內蒙古[20]、河北[19]及山西[34]等地，不同地方分離到的病原菌不同，而在同一地方由于采集地區不同，病原菌的種類也有所不同。

通過對新疆馬鈴薯根腐病的調查、病原菌的分離、形態學特征觀察、分子生物學鑒定及致病性測定，確定引起該病害的病原菌為尖孢鐮刀菌、茄病鐮刀菌、銳頂鐮刀菌、芬芳鐮刀菌和木賊鐮刀菌。對由鐮刀菌引起的馬鈴薯根腐病在新疆地區報道較少，通過本試驗確定引起新疆馬鈴薯鐮刀菌根腐病的主要病原菌，為以后防治新疆馬鈴薯根腐病提供一定依據。