Bacillus amyloliquefaciens Y-3保鮮劑的制備及對番茄貨架期的影響

張曉宇,張立新,高振峰,張新憲,秦一帆,劉 楓

(1.山西省農業科學院 農產品貯藏保鮮研究所,太原 030031；2.山西省農業科學院 農業科技信息研究所,太原 030006)

番茄營養價值高、產量高、需求量大，種植面積不斷擴大，但皮薄、肉嫩，不耐貯運，使其在采后到餐桌的“最后一公里”易發生腐爛，其病因主要包括生理軟化和病原物侵染，其中以病原物致病引起的果實腐爛較為常見[1-2]。研究發現番茄采后病原主要包括葡萄孢菌(Botrytisspp.)、鏈格孢菌屬(AlternariaNees)、根霉屬(Rhizopusspp.)、青霉菌屬(Penicillumspp.)、曲霉屬(Aspergillusspp.)和鐮刀菌屬(Fusariumspp.)等，其中以番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)和番茄早疫病菌(Allternanasolani)引起的腐爛較為常見[3]。番茄貯藏期間由灰霉病菌引起的腐爛率可達1%～20%，有時甚至高達50%[4]；童志丹[5]研究發現在番茄早疫病菌感染下，番茄貯藏15 d腐爛率便可達40%左右；周防震[6]研究發現在番茄灰霉病菌感染下，貯藏20 d腐爛率便可達60%。另外，還有研究發現番茄采后受到病原(B.cinerea)侵染時，會導致體內乙烯釋放量顯著增加，從而加速果實衰老和腐爛速率，縮短其采后貯藏或貨架時間[7]。試驗期間課程組(山西省農業科學院農產品貯藏保鮮研究所果蔬采后病害生物防治課題組)發現番茄早疫病菌不僅同番茄采后腐爛有關，而且在貨架期間發病較快，常在果蒂部位出現褐色病斑，使番茄在發生腐爛之前便失去商品價值。因此，有關番茄采后灰霉和早疫病害控制對降低番茄采后貨架或貯藏期間腐爛率具有重要意義。

目前為有效減少由于灰霉病和早疫病病害發生而導致的番茄貨架和貯藏期間腐爛現象，研究者已對植物提取物(丁香精油、月桂精油和阿魏酸等)[3,8-9]、殺菌劑(NaClO、ClO2和水楊酸甲酯等)[10-12]、水處理(熱水、富氫水)[10,13-14]、拮抗微生物[13,15-16]以及包裝材料處理[1]等方法對灰霉病和早疫病病害防治效果進行了探究，并取得一定成果，但由于見效速率、成本、易操作性，生物保鮮研究仍停留在平板抑菌效果測定和活體接種病原抑菌效果測定以及生物保鮮產品研發和應用效果研究等方面。目前對灰霉病和早疫病種采后病害仍以化學防治為主，然而化學藥劑不合理使用帶來的環境污染、食品藥劑殘留和病原物抗藥性增強等問題亦不容忽視[6]。另外，人們為延長番茄采后貯藏和貨架時間，通常在成熟前(綠果期)便進行采收，然后低溫貯藏，待其轉紅后進行上市，導致市面番茄失去原有味道和出現烹飪時不易軟化現象，影響食用口感，因此，后期不僅有關生物保鮮劑的開發和貨架效果驗證研究還需進一步加強，有關紅熟番茄的采后貯藏及貨架保鮮技術研究顯得尤為重要。

本研究從綠色、安全和生物防治角度出發，一方面對番茄采后灰霉病和早疫病具有良好防治效果的解淀粉芽孢桿菌Y-3進行可濕性粉生物保鮮劑制備配方探究，以期獲得同菌株Y-3具有良好生物相容性的制劑配方；另一方面對該生物保鮮劑對番茄采后早疫病和灰霉病病原的活體抑菌效果和稀釋倍數進行研究來驗證制劑活體防效。最后在獲得制劑成品后，模擬番茄貨架環境對制劑在紅熟番茄貨架期間腐爛的控制效果進行試驗，旨在為番茄采后早疫病和灰霉病安全防治以及延長紅熟番茄貨架供應時間提供新型綠色 產品。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株 解淀粉芽孢桿菌Y-3(CGMCC NO.14113)從抱莖苦荬菜葉片表面分離，番茄采后病原真菌灰霉病菌(Botrytiscinerea)和早疫病菌(Allternanasolani)由山西省農業科學院農產品貯藏保鮮研究所提供；供試番茄2017-07-03采收于山西省太谷縣任村鄉郝村，品種為‘歐寶三號’，初始果實硬度386 g/mm2，挑選果面無機械傷的番茄用于試驗。

1.1.2 供試培養基 營養瓊脂(NA)培養基、營養肉湯(NB)培養液和馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基的配方及制備參照高振峰[17]文獻中的描述。

1.2 菌株活化

1.2.1 Y-3菌株活化 取-80 ℃保存的菌株 Y-3 20 μL采用涂布法涂布于新鮮NA平板，置于26 ℃恒溫活化培養24 h，用于后續試驗。

1.2.2 番茄采后病原真菌活化 用打孔器從病原真菌平板上取直徑為5 mm的菌塊，接種至新鮮的PDA平板，置于26 ℃電熱恒溫培養箱活化培養7 d，用于后續試驗。

1.3 Y-3菌株發酵培養和抗逆性芽孢制備

用接種環取活化后的Y-3菌株1環至新鮮NB無菌液中，于160 r/min、28 ℃發酵培養5 d后，使用血球計數板在顯微鏡下鏡檢，并記錄菌株總數和無芽孢菌株總數，當其抗逆性芽孢產生 率達90%以上時終止發酵，用于可濕性粉劑 制備。

1.4 Y-3菌株可濕性粉生物保鮮劑的制備

1.4.1 載體前處理 在高嶺土、硅藻土、膨潤土、玉米粉、食用麥麩、木屑、滑石粉和白炭黑中篩選，將各載體分別經粉碎機粉碎，使細度小于或等于44 μm，分裝于250 mL磨口瓶，高溫高壓滅菌鍋滅菌30 min，置于50 ℃烘箱烘干備用。

1.4.2 載體吸附特性測定及最佳載體篩選 載體吸附特性測定：取滅菌載體10 g置于90 mm培養皿中，緩慢加入Y-3發酵液(每次1 mL)，使載體濕潤并保持疏松不結塊，直至加到呈現稀糊狀為止，此時已加入的發酵液體積即為載體的最大吸附量，比較吸附量確定載體的吸附特性。各處理和各試驗均重復3次。

最佳載體篩選：依據各載體吸附性能，參照中華人民共和國行業標準NY/T2293.1-2012《細菌微生物農藥枯草芽孢桿菌第1部分：枯草芽孢桿菌母藥》進行Y-3菌株母粉制備：將Y-3發酵液和各類載體按相應比例混合制成母液；置于45 ℃鼓風干燥箱烘干；經粉碎后過200目篩，制成初始制劑(母藥)。隨后對使用不同載體制備成的母粉的潤濕時間、懸浮特性和活菌數量進行檢測分析。活菌數量測定采用平板稀釋涂布法[18]。潤濕時間測定參照文獻 [19]，懸浮率測定參照文獻 [20]。各處理和各試驗均重復3次。

1.4.3 助劑(潤濕劑、分散劑)種類、配比和用量篩選 助劑種類篩選及生物相容性測定：將11種助劑[木質素磺酸鈣、木質素磺酸鈉、拉開粉BX、凈洗劑LS、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、聚乙二醇8000、羧甲基纖維素鈉、分散劑MF、十二烷基硫酸鈉、朗鈦CF-200和朗鈦LT-WP60]分別按照10%添加量加入到以最佳載體制備好的母藥中，鼓風干燥箱45 ℃烘干后粉碎。室溫貯藏30 d后對其潤濕時間、懸浮特性以及同菌株Y-3的生物相容性進行測定，旨在篩選出懸浮性、潤濕時間和生物相容性均較好的助劑。各處理和各試驗均重復3次。

助劑用量最佳配比及生物相容性測定：將分散劑和潤濕劑以最佳配比按照質量比2%、4%、6%、8%、10%的用量添加到母藥中并粉碎[21]。室溫貯藏30 d后對制劑的潤濕時間、懸浮特性和芽孢含量進行測定，以懸浮性高、潤濕時間短和芽孢含量高為較優配比評價指標。

1.4.4 穩定劑篩選 在上述最佳配方中分別加入2%(質量比)穩定劑(CMC-Na、碳酸鈣、磷酸鉀和磷酸氫二鉀)，經粉碎過篩后，測定潤濕時間、懸浮特性、初始活菌數及室溫貯藏30 d后的活菌數，以室溫貯藏30 d后活菌數下降最少的為最佳穩定劑。

1.4.5 Y-3可濕性粉生物保鮮劑的制備 將篩選出的最佳載體、潤濕劑、分散劑與Y-3發酵液按照篩選出的最佳比例混合，45 ℃烘干后，粉碎至細度小于或等于44 μm，制得生物保鮮可濕性粉劑。將制劑分裝為每袋凈質量10 g的小包裝，陰涼干燥處保存，用于后續試驗。

1.5 Y-3可濕性粉生物保鮮劑不同稀釋倍數對番茄采后病害的防治效果

1.5.1 不同稀釋倍數可濕性粉生物保鮮液制備 用無菌水將Y-3可濕性粉保鮮劑分別稀釋 0倍、100倍、300倍、500倍和800倍，以等量不含Y-3的空白制劑為對照。

1.5.2 病害防治效果活體測定 選取大小及成熟度相近的番茄，依次經w=3% NaClO和φ=75%乙醇溶液浸泡5 min，無菌水清洗3次，無菌濾紙擦干后，用打孔器在番茄表面打直徑5 mm、深2 mm的傷口。隨后將“1.5.1”中制備的6種不同濃度處理液分別取20 μL接種于番茄傷口，晾干后，用接種針將直徑5 mm、高2 mm的番茄灰霉病菌和番茄早疫病菌菌餅分別接種至不同番茄傷口中，套袋保濕，25 ℃恒溫培養7 d，參照Zheng等[22]的方法計算不同稀釋倍數保鮮劑的生防效果。每處理10個番茄，試驗重復3次。

1.6 Y-3菌株可濕性粉生物保鮮劑對番茄貨架腐爛率和病果率的影響

選取大小和成熟度相近番茄，使用“1.5”中篩選出的Y-3菌株可濕性粉生物保鮮劑最大稀釋倍數對紅熟期番茄果實進行15 min浸泡處理，以清水浸泡為對照，以不做任何處理為空白對照。浸泡晾干后，置于20 ℃進行番茄貨架試驗，每隔1 d統計番茄腐爛率和病果率。每處理10 kg番茄，重復3次。

腐爛率=腐爛果實數100/果實總數×100%

病果率=病果數/果實總數×100%

2 結果與分析

2.1 Y-3菌株可濕性粉生物保鮮劑制備

2.1.1 載體篩選 不同載體由于其自身的特性差異，對制劑特性會產生一定影響。由表1看出，木屑吸附效果最好、麥麩次之，白炭黑最差。除載體為滑石粉和高嶺土潤濕時間超過20 s外，其余載體的潤濕時間均低于20 s，說明各類載體都具有較好的潤濕特性。同潤濕時間相比，各載體在懸浮率方面則差異較大，載體為膨潤土和滑石粉的懸浮率在75%以上，而其他載體的懸浮率均低于60%，也低于農業部行業標準(NY/T 2293.2-2012)中規定的75%[23]。載體為膨潤土和木屑的制劑， Y-3菌株存活率較高，均在1.6×108cfu/g以上；其次為高嶺土、硅藻土、玉米粉和麥麩，均在1.50×108cfu/g以上；白炭黑存活率最低，僅為1.28×108cfu/g。綜合各載體參數特征，膨潤土作為載體時，可有效保證生物制劑的懸浮率、潤濕時間和菌株存活率，是Y-3菌株可濕性粉生物保鮮劑的最佳載體。

表1 不同載體對制劑特性的影響Table 1 Effects of different carriers on formulation characteristics

注：同列不同小寫字母表示在P<0.05水平上差異顯著。下同。

Note:Different lower case letters in the same column indicate significant differences atP<0.05.The same below.

2.1.2 助劑(潤濕劑、分散劑)篩選 不同助劑對Y-3菌株可濕性粉生物保鮮劑的特性影響進行研究后發現，不同助劑類型之間差異顯著。由表2看出，添加助劑后對制劑的潤濕時間、懸浮率和活菌數都有顯著影響，其中潤濕時間普遍出現增加現象，凈洗劑LS潤濕時間較長，為186.44 s；聚乙二醇8000(PEG 8000)最短，為20.13 s。雖然凈洗劑LS延長了制劑的潤濕時間，但可有效提高制劑懸浮率，懸浮率可達77.44%，在各試驗助劑中效果最好。在菌株存活率方面，凈洗劑LS和PEG 8000存活率最高，分別為1.60×108cfu/g和1.58×108cfu/g，說明凈洗劑LS可有效提高制劑懸浮率和保持菌株存活率。綜合潤濕時間、懸浮率和菌株存活率后，選擇PEG 8000和凈洗劑LS相配合來提高制劑的懸浮率和降低潤濕時間。

表2 不同助劑對制劑特性的影響Table 2 Effects of different additives on characteristic of formulation

2.1.3 助劑配比對Y-3菌株可濕性粉生物保鮮劑特性的影響 由表3看到，PEG8000和凈洗劑LS之間不同配比對Y-3菌株可濕性粉生物保鮮劑菌株存活率影響較小，但對潤濕時間和懸浮率則具有較大影響。當配比為1∶9時懸浮率和潤濕時間最高、最長，分別為80.63%和163.48 s，其中潤濕時間高于國標規定的120 s；當配比為 9∶1時，潤濕時間最短，為18.18 s，但懸浮率較低，僅為24.89%，低于農業部行業標準(NY/T 2293.2-2012)中規定的75%[23]；當配比為4∶6時，懸浮率可達75%，且潤濕時間均低于120 s，符合農業部有關微生物制劑的質量要求。綜合考慮潤濕時間和懸浮率后，選擇4∶6為助劑PEG8000和凈洗劑LS的最佳比例。

2.1.4 助劑添加量對Y-3菌株可濕性粉生物保鮮劑特性的影響 由表4看到，助劑添加量對制劑潤濕時間和懸浮率影響較大，但對菌株存活量影響較小。隨著助劑添加量的增加，潤濕時間呈遞增趨勢，懸浮率也呈上升趨勢，且不同添加量下潤濕時間和懸浮率均滿足國標要求。綜合考慮潤濕時間、懸浮率以及經濟因素后選擇4%作為助劑的最佳添加量。

表3 不同助劑比例對制劑特性的影響Table 3 Effects of different ratios of additives on characteristic of formulation

2.1.5 穩定劑對Y-3菌株可濕性粉生物保鮮劑特性的影響 由表5看到，羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)可有效保持Y-3菌株存活率，下降率僅為1.86%，且對制劑潤濕時間和懸浮率影響不大，效果優于其他種類穩定劑(表5)。因此選擇2% CMC-Na為Y-3菌株可濕性粉生物保鮮劑的最佳穩定劑。

表4 不同助劑添加量對制劑特性的影響Table 4 Effects of different dosages of compounding additive on characteristic of formulation

表5 不同穩定劑對制劑特性的影響Table 5 Effects of different stabilizers on characteristic of formulation

2.2 Y-3菌株可濕性粉生物保鮮劑稀釋倍數及番茄采后病害活體抑菌效果

由表6和圖1看到，當Y-3菌株可濕性粉生物保鮮劑稀釋倍數高于300倍時，對番茄采后B.cinerea和A.solani活體抑菌效果明顯下降，均低于70%；當稀釋倍數為300時，雖然防治效果低于0和100倍，但防效仍在70%以上。綜合防治效果和經濟因素，確定該生物保鮮劑的最大稀釋倍數為300倍。另外，從圖1還可看出，采后番茄在灰霉病病原侵染點周圍出現明顯腐爛的水漬狀癥狀，進一步說明該病原是造成番茄采后腐爛的重要病原之一。

2.3 Y-3菌株可濕性粉生物保鮮劑對番茄貨架期病果率和腐爛率的影響

模擬貨架環境對Y-3菌株可濕性粉生物保鮮劑對紅熟番茄貨架期病果率和腐爛率控制效果

表6 不同濃度菌株Y-3可濕性粉生物保鮮劑對番茄采后灰霉和早疫病害的活體抑菌效果Table 6 Antifugnal activity of wettable powder biological preservative of stain Y-3 against postharvest disease of B.cinerea and A.solani of tomato in vivo at different dilution times

進行測定后發現：紅熟番茄在不經任何處理時，于20 ℃貨架3 d和5 d便開始出現腐爛和病果現象；當貨架至7 d時，腐爛率和病果率便分別已達20%和10%以上，對番茄商品價值造成較大影響；貨架至11 d時，腐爛率和病果率總和已達50%以上(表7)。番茄經清水清洗后，同不經處理相比腐爛時間可后延2 d；病果出現時間雖同空白對照相同，但病果率(2.71%)低于空白對照 (3.36%)，且相同貨架時間下病果率和腐爛率均低于空白對照，說明番茄采后清洗可在一定程度上降低番茄采后腐爛率和病果率。然而，同空白對照和清水浸泡對照相比，紅熟番茄經Y-3菌株可濕性粉生物保鮮劑浸泡15 min處理后，不僅可顯著推遲其貨架期間腐爛和病果現象出現時間，分別在貨架6 d和7 d時開始出現腐爛和病果，而且相同貨架時間下，Y-3菌株可濕性粉生物保鮮劑處理組病果率和腐爛率均顯著低于清水對照和空白對照；紅熟番茄經該制劑浸泡處理15 min后可使貨架時間延長至11 d，且將腐爛率和病果率總和控制在10%左右(表7)，明顯低于清水浸泡對照和空白對照，說明Y-3菌株可濕性粉生物保鮮劑在延長紅熟番茄20 ℃貨架時 間和降低腐爛率與病果率方面具有較好應用 潛力。

A1～A6和B1～B6均依次為對照、稀釋0倍、稀釋100倍、稀釋300倍、稀釋500倍和稀釋800倍 A1-A6 and B1-B6 all represent control,diluted 0 time,diluted 100 times,diluted 300 times,diluted 500 times and diluted 800 times

圖1 菌株Y-3可濕性粉生物保鮮劑對番茄采后灰霉病菌(A)和番茄早疫病菌(B)的活體抑菌效果
Fig.1 Antifugnal activity of wettable powder biological preservative of stain Y-3 against postharvestdisease ofB.cinerea(A) andA.solani(B) of tomato in vivo at different dilution times

表7 Y-3菌株可濕性粉生物保鮮劑浸泡處理對番茄采后貨架腐爛和病害控制效果Table 7 Control effect of soaking treatment of strain Y-3 wettable powder biological preservative on decay and disease of tomato during postharvest shelf

3 結論與討論

采用單因素試驗和平板活菌數量檢測方法對Y-3菌株可濕性粉生物保鮮劑配方和配方中各成分同菌株Y-3之間的生物相容性進行測定后發現：Y-3菌株可濕性粉生物保鮮劑的最佳載體為膨潤土，最佳助劑組合為凈洗劑LS、羧甲基纖維素鈉和聚乙二醇8000；最佳生物保鮮劑配方為：發酵液70%、膨潤土10%、PEG8000 2.4%、凈洗劑LS 3.6%、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)2%，膨潤土補足100%。該配方中穩定劑種類同李舒雯等[21]、蔡勛超等[24]和王劍等[25]相同，且生防菌株均為芽孢桿菌，進一步說明CMC-Na在保護芽孢桿菌存活方面具有較好作用。除穩定劑外，其他試劑用量及種類均存在一定差異，如：枯草芽孢桿菌B99-2的最佳配方為硅藻土10%，分散劑PVA 7.2%，潤濕劑D425 4.8%，穩定劑CMC-Na 2.0%，保護劑FWA 0.1%[25]；內生短芽胞桿菌011可濕性粉劑最佳配方：滑石粉10%，木質素磺酸鈣7%，DBS 3%，CMC-Na 2%，糊精 0.1%[21]；枯草芽孢桿菌B1514最佳配方為搖瓶發酵液70%、硅藻土18%、CMC-Na 4.8%、PEG8000 7.2%[26]。造成制劑配方中的差異可能與菌株自身特性差異關系較為密切。

在明確Y-3菌株可濕性粉生物保鮮劑配方后，還通過活體試驗對制劑的稀釋倍數和番茄采后早疫和灰霉病病原抑菌效果進行了測定，結果發現：稀釋300倍為該制劑的最大稀釋倍數，在該稀釋倍數以下對2種病原的抑菌效果可保持在75%以上；當稀釋500時，抑菌效果出現較大下降，對番茄灰霉病菌和番茄早疫病菌的防治效果僅為69.63%和59.99%，說明該制劑的最大稀釋倍數為300倍。稀釋倍數同化學藥劑田間用藥倍數相比較低，可能與制劑中的活菌數量、生物菌劑活性以及作用效果緩慢等存在一定關系。另外，該菌株制劑稀釋倍數同貝萊斯芽孢桿菌菌株S6可濕性粉劑[27]和枯草芽孢桿菌B36菌株可濕性粉劑[28]相比稀釋倍數較低，但同每克枯草芽孢桿菌含10億芽孢可濕性粉劑[29]和枯草芽孢桿菌D-29可濕性粉劑[30]相比稀釋倍數較大，進一步說明不同菌株制備成的可濕性粉劑在同種病害防治和不同種病害防治中存在一定活性差異，造成這種差異的原因可能與菌株自身差異、植物品種、用藥時間、用藥方式以及用藥環境存在一定差異有關。

隨后，為進一步明確制劑的實際應用效果，本研究還模擬超市貨架環境，在單位保鮮庫20 ℃條件下，采用浸泡15 min處理對制劑應用效果進行驗證。結果發現：紅熟番茄經該制劑浸泡15 min可有效降低番茄貨架期間的病果率和腐爛率；同對照相比可使貨架時間延長至11 d。防治效果同王金玉等[10]的處理方式NaClO(可使成熟番茄在20 ℃貨架7 d)相比，效果較優；同Asgar等[31]的阿拉伯樹膠處理(可使綠果番茄在20 ℃下貨架20 d)和王文輝等[32]的1-MCP處理(可使番茄室溫貨架期后延7 d)相比效果略差，造成這些差異的原因可能同番茄成熟度和品種存在差異有關。另外，試驗過程中還發現在無外源灰霉和早疫病病原接種的情況下，番茄在貨架期間的主要病害表現為番茄早疫病，而無番茄灰霉病害發生，同已報道的研究結果(B.cinerea是引起番茄采后腐爛的主要病原)[11-12]存在差別，造成這種差異原因可能同本研究沒有采用外源接種病原或番茄采收前的病害發生情況有關。

本研究發現Y-3菌株可濕性粉生物保鮮劑制備配方、稀釋倍數、活體抑菌效果以及對紅熟番茄采后貨架期間的腐爛率控制有一定效果，但在后期研究中還尚需對制劑在不同品種番茄中的應用效果、采前應用效果、不同成熟度番茄應用效果、番茄貯藏中試試驗、推廣應用以及制劑劑型改良等方面進行大量研究，以期為該菌株和制劑的市場化應用奠定堅實基礎。