超表達枳β-淀粉酶基因( PtrBAM1)對煙草不同糖和有機酸的影響

肖 暢，彭 婷

(1.湖北廣播電視大學 導學中心，武漢 430000; 2.贛南師范大學 生命科學學院，江西贛州 341000)

低溫脅迫常常引起植物新陳代謝的劇烈變化，酶活性和反應速率普遍降低，代謝物得到重新配置。低溫馴化時，特定代謝產物如碳水化合物、氨基酸、有機酸等在植物體內積累，其有利于增強植株的耐寒性[1]。

淀粉是植物體內的主要碳水化合物，常見于根、根莖、莖、塊莖和種子等儲藏器官[2]。淀粉的合成主要是利用光合作用固定二氧化碳，并暫時存儲在葉綠體中，這種在24 h內合成和降解的淀粉被稱為“暫時性淀粉”[3]。主要參與淀粉水解途徑的5種酶有α-淀粉酶(α-amylase)，β-淀粉酶(β-amylase， BAM)、極限糊精酶(limit dextrinase)、β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)和α-葡聚糖磷酸化酶(α-glucan phosphorylase)[4]。淀粉水解產生的代謝物可用于谷物萌發、幼苗生長、胚乳發育以及對非生物脅迫的反應等[5]。有研究[5]表明，淀粉水解代謝途徑的主要酶為BAM，主要產物為β-麥芽糖，其迅速被轉化為葡萄糖，用于蔗糖的合成，從而將葉綠體中的淀粉降解與細胞質中的糖代謝聯系起來。

在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中已經鑒定有9個BAMs[6]，香蕉(Musanana)中有16個BAMs[7]，白梨(Pyrusbretschneideri)中17個BAMs[4]，枳(Poncirustrifoliata)中有8個BAMs[8]。其中， AtBAM3和PtrBAM1分別是擬南芥和枳葉片葉綠體中夜間降解淀粉的主要水解酶[9]。BAM不僅是植物中重要的淀粉水解酶，在植物非生物脅迫反應中也具有重要作用。研究表明，BAMs能夠通過促進活性氧的清除和增加可溶性糖類的含量以提高植株的抗脅迫能力[9-10]。可溶性糖一方面作為重要的滲透保護劑和相容性溶質以減輕不良環境壓力對植物的影響[11]，另外一方面可作為信號分子與脫落酸(ABA)依賴的信號通路相互作用，激活應激反應級聯中的下游成分[12]。有機酸的積累和代謝受多種環境因素的調節，但BAM對有機酸的影響目前鮮見報道。

盡管BAM在模式植物中已經被鑒定，但是在多年生果樹中的抗非生物脅迫研究仍然較少。柑橘是一種亞熱帶果樹，性喜溫暖不耐寒霜，近年來隨著柑橘的廣泛種植和全球環境的不斷惡化，持續低溫以及春季“倒春寒”天氣成為制約柑橘產業發展的一大不利因素。研究柑橘在低溫條件下的響應機制，提高其抗寒性具有重要意義。Peng等[8]從枳中克隆了與AtBAM3高度同源的PtrBAM1，該基因受到CBF(C-repeat-binding factor)的直接誘導，通過調節可溶性糖的整體水平，在耐寒性過程中發揮重要作用。本研究在已部分鑒定PtrBAM1抗寒功能的前提下，利用PtrBAM1超表達煙草，測定低溫條件下超表達PtrBAM1對煙草中β-淀粉酶活性、可溶性糖和有機酸含量的影響，進一步解析PtrBAM1的功能。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

參試材料為野生型煙草nud、實驗室前期獲得的3個PtrBAM1超表達煙草株系F6、F11、F25及轉化空載株系1301。以野生型nud和空載1301作為2個對照。

1.2 植株生長條件

盆栽種植的煙草置于智能人工氣候箱(HP400G3-C型)，光期/暗期為16 h/8 h，溫度 23 ℃。

1.3 材料處理

對2個月苗齡的nud、1301、F6、F11、F25煙草進行2 ℃低溫處理，在0 h、6 h、1 d、3 d、5 d時取樣，葉片分裝于取樣袋后在液氮中速凍，置于 -80 ℃冰箱，備用。

1.4 β-淀粉酶活性與糖、酸含量的測定

采用Laby等[13]的方法測定β-淀粉酶含量。采用米蘭芳[14]氣相色譜法測定煙草中葡萄糖、蔗糖、果糖、蘋果酸、檸檬酸，奎寧酸含量，儀器為HP7890A型氣相色譜儀。

1.5 統計分析

所有測定數據均為3次重復的平均值。使用SAS 8.1軟件對數據進行統計，用t檢驗法進行顯著性差異分析。

2 結果與分析

2.1 低溫脅迫下不同煙草株系β-淀粉酶活性檢測結果

不同煙草株系在低溫下其β-淀粉酶活性如圖1所示，可以看出，3個超表達株系的β-淀粉酶活性在正常情況下(0 h)、低溫處理6 h、1 d以及3 d均顯著高于nud、1301兩個對照組，并且隨著低溫時間的延長，其活性在1 d到達最高峰，隨后下降，到第5天時，超表達株系與對照相比酶活性無顯著差異。

數據為“平均值±標準誤”；相同字母間代表同一處理時間點不同株系間無差異，不同字母代表差異顯著(P<0.05)。下同 Data were “mean± SE”;different letters indicated significant difference among different lines at the same time point (P< 0.05).The same below

圖1 2 ℃處理下超表達煙草(F6、F11和F25)與
對照(nud和1301)β-淀粉酶活性比較
Fig.1 β-amylase activity of the overexpressing
lines (F6,F11,F25) and controls (nud,1301)
exposed to 2 ℃ treatment

2.2 低溫脅迫下不同煙草株系糖含量的差異性分析

不同煙草株系在低溫下其糖代謝的差異性如圖2所示。0 h時，超表達株系的果糖和蔗糖含量顯著高于對照，而葡萄糖含量顯著低于對照 (P<0.05)。從單個糖來看，除3 d和5 d外，超表達株系果糖含量均顯著高于兩個對照組，總趨勢為0 h到6 h下降后趨于平緩(圖2-A)。由圖2-B可知，在低溫處理下，對照組葡萄糖含量沒有顯著變化，超表達株系煙草的葡萄糖含量在 6 h～1 d時有一個驟升的過程，1 d與6 h相比增加 94.24%，說明在低溫脅迫前期，超表達煙草通過迅速提高葡萄糖含量來響應低溫脅迫。由圖2-C可知，5個煙草株系蔗糖含量均在第1天時達到峰值，并且超表達株系顯著低于兩個對照，在其他時間點與對照無顯著差異。綜上所述，在低溫脅迫下超表達PtrBAM1可能通過顯著提高煙草幼苗內葡萄糖的含量以響應低溫脅迫。

2.3 低溫脅迫下不同煙草株系有機酸含量的差異性分析

不同煙草株系在低溫下有機酸代謝的差異如圖3所示。低溫0 h、6 h和3 d，超表達煙草中蘋果酸含量均顯著高于2個對照(圖3-A)。對照和超表達株系的蘋果酸含量都是未經過低溫處理時含量最高，之后逐漸下降，第5天已無法檢測到(圖3-A)。在低溫脅迫條件下，3個超表達株系檸檬酸含量始終顯著高于2個對照(圖3-B)。在低溫處理初期(0～6 h)，超表達煙草株系奎寧酸含量顯著高于對照組，低溫處理3 d和5 d均無法檢測到(圖3-C)。綜上所述，在低溫處理下，有機酸含量整體下降，但超表達PtrBAM1煙草可能因為在0 h的有機酸含量更高而抗寒性更強。

圖2 2 ℃處理下超表達煙草(F6、F11和F25)與對照(nud和1301)果糖、葡萄糖、蔗糖含量比較Fig.2 The content of fructose,glucose and sucrose of the overexpressing lines (F6,F11,F25) and controls (nud,1301) exposed to 2 ℃ treatment

圖3 2 ℃處理下超表達煙草(F6、F11和F25)與對照(nud和1301)蘋果酸、檸檬酸、奎寧酸含量比較Fig.3 The content of malic acid,citric acid,quinic acid the overexpressing lines (F6,F11,F25) and controls (nud,1301) exposed to 2 ℃ treatment

3 討 論

在長期的進化過程中，植物演化出了一系列復雜的機制來應對惡劣環境，而糖代謝和碳分配在植物低溫馴化過程中起著重要作用[15-16]。糖代謝是一個復雜的酶促反應，涉及如蔗糖、葡萄糖、果糖等多種可溶性糖，其可增加細胞的滲透調節能力，在脅迫中起著積極的作用，是植物響應低溫處理最重要的初生代謝物[17-20]。

擬南芥在低溫脅迫下增加的第一批碳水化合物是由淀粉經BAM水解產生的麥芽糖和麥芽三糖，接著是葡萄糖6-磷酸磷和果糖6-磷酸，然后是蔗糖、葡萄糖和果糖[21]，具體哪種糖在冷脅迫中起主要作用仍沒有定論。黑麥草植株暴露于低溫下8 h，其內源性蔗糖的含量增加了10倍左右[22]。小于10 ℃的低溫貯藏條件下，馬鈴薯塊莖中可溶性糖如蔗糖、葡萄糖和果糖的含量顯著增加，溫度越低，可溶性糖含量越高[23]。擬南芥在4 ℃低溫脅迫下，蔗糖顯著增加，葡萄糖、果糖有少量增加，淀粉量輕微降低[24]。總的來說，可溶性糖在低溫脅迫下會明顯地積累，糖的類型取決于植物種類和脅迫的類型。本研究測定了低溫處理下PtrBAM1超表達系煙草葡萄糖、蔗糖和果糖的含量，其中葡萄糖含量在6 h～1 d時有一個驟升的過程。然而蔗糖在超表達煙草株系含量與對照組沒有顯著差異，表明超表達PtrBAM1沒有促進蔗糖的積累，可能通過產生葡萄糖起作用，這與在麻風樹幼苗中的研究結果相似[25]。Yu等[26]也認為葡萄糖、果糖等單糖作為能源和滲透調節劑，而蔗糖等雙糖常常是植物運輸和儲存碳水化合物等主要形式，說明不同植物種類可能會積累不同的代謝物以適應脅迫。另一方面，在低溫處理后期，超表達煙草與對照的果糖(5 d)和葡萄糖(3 d)含量差異不顯著，可能PtrBAM1在抗低溫脅迫中對可溶性糖代謝的影響發生在早期階段。本研究中3種糖含量的測定表明超表達PtrBAM1低溫脅迫時促進產生的可溶性糖主要成分是葡萄糖，超表達煙草通過迅速提高葡萄糖含量來響應低溫脅迫。

有機酸(蘋果酸、檸檬酸等)主要來源于三羧酸循環和乙醛酸循環的中間產物，在植物的呼吸作用和光合代謝中起著至關重要的作用，所以在高溫處理下由于代謝損傷和光呼吸通量變化導致大豆葉片中檸檬酸、蘋果酸等有機酸含量顯著降低[27]。番茄低溫寡照處理下，根系有機酸分泌量顯著降低[28]。本研究中在低溫處理下，有機酸含量也是整體下降，其中蘋果酸和奎寧酸經歷了一個下降-升高-再下降的過程，這與番茄果實在4 ℃處理下，蘋果酸的含量先增加后下降相似[29]。PtrBAM1超表達煙草在0 h時蘋果酸、檸檬酸和奎寧酸含量都顯著高于對照，低溫開始后蘋果酸和奎寧酸都急劇下降。前期研究已證明PtrBAM1超表達煙草較對照更為抗寒[8]，可能是因為正常條件下超表達株系有機酸含量更高，因為有機酸一方面能夠提高光合效率，另一方面可以調節細胞的pH，可能在提高植物的抗逆性中起一定作用[30-32]。

4 結 論

綜上所述，正常條件下PtrBAM1超表達煙草的果糖、蔗糖、蘋果酸、檸檬酸、奎寧酸含量及β-淀粉酶活性顯著高于對照，低溫處理后超表達煙草β-淀粉酶活性和葡萄糖含量顯著增加，其他糖和有機酸含量都發生了改變，表明PtrBAM1在低溫處理下可能通過改變糖酸代謝途徑增強植株的抗寒性。具體的作用機制還有待進一步研究。