小麥再生相關基因 TaDCC1-2B的克隆與功能驗證

賈冬冬，王京宏，崔桂賓，張舒夢，張 超，孫風麗，王竹林，奚亞軍

(1. 西北農(nóng)林科技大學 農(nóng)學院, 陜西楊凌 712100；2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西北地區(qū)小麥生物學與遺傳育種重點實驗室, 陜西楊凌 712100)

現(xiàn)階段小麥再生效率低，遺傳轉化相對困難，已經(jīng)成為制約小麥功能基因組研究的主要障礙之一。高效的組織培養(yǎng)再生體系對于推進運用轉基因和基因編輯技術改良小麥品種具有重要意義。植物離體組織培養(yǎng)是一個復雜的無性繁殖過程, 通常包括愈傷組織的誘導和分化再生[1]。離體再生過程受到內(nèi)外多種因素的影響，來自外部的誘導因子主要有外源激素、環(huán)境脅迫(包括氧化脅迫、滲透脅迫等)、培養(yǎng)基生化添加物等[2]，而基因型是影響組織培養(yǎng)的重要內(nèi)部因素，其與再生能力及遺傳轉化率密切相關[3-4]。因此，挖掘并克隆、轉化小麥再生相關基因，不但有助于提高小麥優(yōu)良基因型的再生能力和小麥組織培養(yǎng)再生率及轉化效率，極大地減少組織培養(yǎng)工作量，而且利用來自小麥自身的再生相關基因作為篩選標記,可以獲得無抗生素等篩選標記的安全型轉基因植株, 有利于轉基因小麥的安全性評價和商業(yè)化種植, 是一個極具價值的研究方向[5]。

小麥屬于異源六倍體作物，遺傳組成異常復雜，因此要篩選并克隆出控制小麥組織培養(yǎng)再生的主效基因極其困難。在模式物種擬南芥中已克隆了一些與體細胞胚發(fā)生相關基因，主要分為兩類：(1)控制胚胎發(fā)育特征相關基因主要包括LEC1、LEC2、FUS3、AGL15等[6-12]和WOXs家族基因WOX5、WOX 11、WOX 12等[13-14]，以及AP2/ERF型轉錄因子BBM、EMK、WIND1、ESR1、PLT、ARRS等[15-20]；(2)與芽頂端分生組織相關的基因有STM、CLV3、WUS等[21-27]。在其他作物中也有與體外再生和胚胎發(fā)育相關的基因報道。Schmidt等[28]在胡蘿卜中首次發(fā)現(xiàn)調(diào)控體細胞向胚性細胞轉變的體細胞胚胎發(fā)生相關類受體蛋白激酶關鍵基因SERK；Nishimura等[29]從高再生水稻Kasalath品種成功分離到控制其再生相關的主效基因鐵氧還蛋白-亞硝酸還原酶基因(Ferredoxin-nitrite reductase,NiR)。研究表明通過異位表達再生相關基因在某種程度上可以啟動體細胞胚胎發(fā)生及提高植物再生能力[30-31]。杜邦先鋒公司利用磷脂轉移酶蛋白基因啟動子PLTP和生長素誘導啟動子Axig1分別驅(qū)動玉米轉錄因子BBM和WUS2，可使農(nóng)桿菌侵染后的玉米幼胚快速形成大量體細胞胚，這些體胚可以直接被轉化并長成植株而不需要經(jīng)過愈傷誘導階段，從而將遺傳轉化的時間縮短至1個月且不依賴玉米基因型[32]，說明啟動子和再生基因有效相結合為解決頑拗型植物困難再生的問題提供了一條新的途徑。

目前已通過同源克隆技術得到一些與小麥再生相關的候選基因，如小麥體細胞胚胎受體類激酶基因TaSERKs[33]、亞硝酸還原酶基因TaNiR[2]、過氧化氫酶基因TaCATs及TaWOX5[3]等，并對其再生功能進行了初步鑒定。然而，目前克隆得到的小麥再生相關基因均未被確定是控制小麥再生的主效基因。值得注意的是，中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所報道其從小麥品系CB037中鑒定出再生相關基因TaCB1，該基因與日本煙草公司PureWheat技術結合可以顯著提高小麥再生能力及轉化效率，而且TaCB1基因共轉化小麥幼胚基本上克服了對小麥基因型的依賴性，但此專利在小麥組織培養(yǎng)實踐應用中的實用性及廣泛性有待驗證。

Zhang等[34]首次在擬南芥自然變異種中發(fā)現(xiàn)決定其再生能力的一種新的硫氧還蛋白DCC1。DCC1與線粒體呼吸鏈中NADH脫氫酶復合體(復合體I)的一個重要亞基CA2直接相互作用，通過對CA2的氧化還原修飾調(diào)控復合體I活性，DCC1的突變將導致復合體I的活性降低，誘發(fā)線粒體ROS水平增加，而ROS含量的激增將影響芽分生組織形成相關基因WUS、STM、CLV3等的表達，進而抑制芽的再生，因此鑒定出硫氧還蛋白DCC1是決定擬南芥再生能力的關鍵蛋白[25,35]。本試驗以小麥品種‘中國春’為試驗材料，采用同源克隆法獲得小麥硫氧還蛋白TaDCC1-2B基因的全長序列，對其進行分子生物學特性分析，并利用農(nóng)桿菌介導法對該基因的功能進行初步鑒定，以期為挖掘小麥再生相關基因和研究再生作用的分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 植物材料及種植條件 試驗中用到的擬南芥材料有野生型Columbia-0(Col-0)、擬南芥硫氧還蛋白突變體dcc1 (SALK_051222C)，由山東農(nóng)業(yè)大學張憲省課題組饋贈。Col-0和dcc1種子在4 ℃條件春化3 d后點播于基質(zhì)中，然后將其轉移至人工氣候室，培養(yǎng)條件為：溫度設置為 25 ℃，光周期為16 h光照/8 h黑暗，光照強度為150 μmol·m-2·s-1，相對濕度為70%。基因克隆所用的小麥模板為普通小麥‘中國春’三葉一心期葉片的cDNA。

1.1.2 菌株與載體 試驗中所用的大腸桿菌菌株為EscherichiacoliDH5α，根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株為GV3101。載體構建時所用的克隆載體為pLB零背景快速克隆試劑盒提供的克隆載體pLB Vector，用于擬南芥轉化的過表達載體為pGreenⅡ-OE。

1.1.3 主要化學試劑與儀器 基因擴增及菌落PCR過程中用到的KOD高保真酶、Taq酶及pLB零背景快速克隆試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒等購于天根生化科技(北京)有限公司(德國)。限制性內(nèi)切酶購自Thermo Fisher Scientific公司(馬薩諸塞州，美國)，一步克隆試劑盒(ClonExpress○RII One Step Cloning Kit)和Magen RNA提取試劑盒分別購自南京諾唯贊生物科技有限公司(南京，中國)和廣州美基生物科技有限公司(廣州，中國)。RNA反轉錄及實時熒光定量PCR試劑盒購自Takara公司(日本)，引物合成及測序由楊凌天潤奧科生物科技有限公司(楊凌，中國)完成。使用QuantStudio○R5 Real-Time PCR儀(Thermo Scientific，馬薩諸塞州，美國)進行qRT-PCR擴增。

1.2 方 法

1.2.1TaDCC1基因克隆和表達載體構建 以擬南芥硫氧還蛋白DCC1(AT5G50100)的氨基酸序列為探針在Ensemble Plants小麥數(shù)據(jù)庫(http://plants.ensembl.org/Triticum_aestivum/Info/Index)進行比對，得到3條高度相似且定位在小麥2A、2B、2D長臂上的序列，對應的序列號分別為TraesCS2A01G540200.1、TraesCS2B01G570 600.1 和TraesCS2D01G541900.1。根據(jù)小麥3條同源序列的保守區(qū)域利用Primer 6.0軟件設計擴增同源基因引物。引物序列信息見表1。以‘中國春’cDNA為模板，使用KOD高保真酶進行目的基因序列的PCR擴增。利用DNA凝膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進行回收后，利用紫外分光光度計檢測目的PCR片段濃度，參照pLB零背景快速克隆試劑盒說明計算插入目的片段的使用量，并按照說明書粘性末端連接方法連接載克隆體和目的片段，并將連接產(chǎn)物轉化到大腸桿菌感受態(tài)DH5α，挑選12個經(jīng)PCR鑒定條帶正確的陽性克隆送至楊凌奧科測序公司進行測序。利用一步克隆試劑盒構建表達載體時登錄諾唯贊官網(wǎng)(http://www.vazyme.com)下載引物設計軟件 CE Design，根據(jù)說明引物設計總原則，選擇XhoⅠ和XbaⅠ作為酶切位點，對插入目的片段設計帶有載體末端同源序列 + 酶切位點(可保留或刪除) + 基因特異性擴增引物序列的上下游引物，以連接成功的克隆載體為模板，擴增插入表達載體的目的片段，并用XhoⅠ和XbaⅠ對表達載體pGreenⅡ-OE質(zhì)粒線性化，凝膠電泳檢測并回收擴增和酶切產(chǎn)物，按照說明進行重組反應，重組產(chǎn)物轉化，利用表達用載體測序引物進行PCR鑒定陽性克隆，將陽性克隆轉化農(nóng)桿菌感受態(tài)，進一步PCR鑒定，保存轉化成功的農(nóng)桿菌 菌液。

1.2.2TaDCC1基因的表達量分析TaDCC1基因具有3個序列高度相似的基因拷貝，利用NCBI在線引物設計工具在TaDCC1-2A、TaDCC1-2B和TaDCC1-2D序列保守區(qū)域設計引物對(表1)，檢測3個TaDCC1基因在小麥中的相對表達量；以Actin為小麥內(nèi)參基因，設計引物Actin-F/Actin-R序列見表1。qRT-PCR體系參照參照TaKaRa定量PCR試劑盒說明書，循環(huán)數(shù)為40，退火溫度為60 ℃，延伸時間35 s。采用2-ΔΔCT法進行基因表達分析，數(shù)據(jù)以“平均值±標準誤”表示，采用ANOVA分析方法進行Duncan’s test測驗，并利用GraphPad Prism7軟件(加州大學圣地亞哥分校，美國)進行作圖。

1.2.3TaDCC1-2B基因編碼蛋白的理化性質(zhì)分析 運用ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)對TaDCC1-2B基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進行分析，利用ExPASyhttp://web.expasy.org/protparam/在線預測蛋白親水性，利用PredictProtein(https://www.predictprotein.org/home)和SWISS MODEL服務器(http：//swissmodel.expasy.org)對蛋白質(zhì)的二級和三級結構進行預測。以TaDCC1-2B蛋白序列為探針，在NCBI網(wǎng)站搜索不同物種的同源蛋白，利用DNAMAN 6.0(LynnonBiosoft公司，美國)和MEGA 7.0軟件(賓夕法尼亞大學，美國)進行蛋白序列的同源性分析和進化分析。系統(tǒng)進化分析采用鄰接法 (neighor-joining) 作圖, 重復次數(shù)設置為1 000。

1.2.4TaDCC1-2B基因啟動子區(qū)域分析 選取TaDCC1-2B基因起始密碼子ATG上游2 000 bp的潛在啟動子區(qū)域，在PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)中預測啟動子區(qū)域順式作用元件。

1.2.5 農(nóng)桿菌介導轉化擬南芥 在擬南芥突變體dcc1開花初期，將過表達載體轉導農(nóng)桿菌(GV3101)感受態(tài)細胞，利用花序蘸染法侵染dcc1花序，將收獲的轉基因T0代種子種植后用除草劑草銨膦篩選，不受除草劑影響的初步認定為陽性植株，提取其基因組DNA，設計草銨膦Bar基因引物(表1)進行PCR鑒定。

1.2.6 擬南芥根尖誘導芽的再生 芽再生試驗參照Li等[36]并稍加修改，將野生型Col-0、突變體dcc1和轉基因T3代種子經(jīng)過70%(V/V)乙醇消毒1 min，8%(V/V)的次氯酸鈉渦旋10 min，并用滅菌水沖洗5～8遍，然后用牙簽將種子點播在萌發(fā)培養(yǎng)基(1/2 MS培養(yǎng)基中添加質(zhì)量分數(shù)為1%蔗糖、0.5 g·L-1MES和質(zhì)量分數(shù)為0.8%瓊脂糖，pH 5.8)，4 ℃春化3 d后，放置在設置條件為溫度22 ℃、光照18 h/黑暗6 h的光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)12 d至根長約5～10 mm，切除根尖并轉入愈傷組織誘導培養(yǎng)基(CIM，MS培養(yǎng)基中添加質(zhì)量分數(shù)為2%蔗糖、0.5 g·L-1MES 、質(zhì)量分數(shù)為0.8%瓊脂糖、0.5 mg·L-12,4-D和 0.05 mg·L-1激動素，pH 5.8)，愈傷連續(xù)培養(yǎng)15 d后轉入再生芽分化培養(yǎng)基(SIM，MS培養(yǎng)基中添加質(zhì)量分數(shù)為2%蔗糖、0.5 g·L-1MES，質(zhì)量分數(shù)為0.8%瓊脂糖、0.5 mg·L-12,4-D和0.05 mg·L-12,4-D，pH 5.8)，SIM培養(yǎng)基每 6 d更換1次。由于突變體dcc1在SIM培養(yǎng)基培養(yǎng)第20天時才誘導分化出再生芽，選擇在分化第25天統(tǒng)計Col-0、dcc1和T3代的芽再生率。分別進行3次生物學重復，每組統(tǒng)計50個愈傷。芽再生率=至少分化出一個芽的愈傷數(shù)目/總愈傷數(shù)×100%。同時，將此時期Col-0、dcc1和T3的再生芽凍存在-80 ℃冰箱，用于qRT-PCR檢測。

1.2.7 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測 再生芽總RNA的提取使用Magen RNA提取試劑盒，方法參照試劑盒說明書。cDNA第一鏈的合成方法參照Takara公司的反轉錄試劑盒說明書。使用QuantStudio○R5 Real-Time PCR實時熒光定量PCR儀進行qRT-PCR擴增。設置3次生物學重復和3次技術重復，PCR反應體系(表2)和反應程序參照TaKaRa定量PCR試劑盒說明書。以WUS(gene ID, At2g17950)作為再生芽標記基因，TUB2(gene ID，At5g62690)為內(nèi)參基因，設計定量PCR引物(表1)，分析TaDCC1-2B基因及WUS基因在野生型、突變體及轉基因擬南芥在SIM誘導分化培養(yǎng)第25天的再生芽的表達水平。PCR反應程序：95 ℃ 5 s，95 ℃ 30 s， 60 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，30個循環(huán)；95 ℃ 5 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，72 ℃ 10 s ，40個循環(huán)。數(shù)據(jù)分析同“1.2.2”。

表1 試驗所用引物Table 1 Primers used in this study

表2 qRT-PCR反應體系Table 2 The system of qRT-PCR reaction

2 結果與分析

2.1 基因克隆及過表達載體連接凝膠電泳分析

從‘中國春’cDNA中擴增到大小為650 bp左右的條帶(圖1)，對該條帶進行膠回收、連接、轉化、挑菌、測序后發(fā)現(xiàn)同時擴增得到來自小麥2A、2B、2D基因組上的3個同源基因序列，分別命名為TaDCC1-2A、TaDCC1-2B和TaDCC1-2D，其CDS序列全長均為645 bp，三者CDS相似度達到98.40%，氨基酸序列相似度達98.44%，其中TaDCC1-2B的氨基酸序列和TaDCC1-2A、TaDCC1-2D同源性均達到97.20%，TaDCC1-2A的氨基酸序列和TaDCC1-2D同源性達到 96.26%。

M.D2000 Maker；1.目的條帶 Target band

對利用一步克隆試劑盒構建的過表達載體進行PCR鑒定，測序引物為表達載體測序引物，擴增得到約為850 bp的條帶(圖2)，符合目的條帶大小，表明插入的目的片段和線性化載體連接 成功。

2.2 TaDCC1基因的表達量分析

由圖3可知，以‘中國春’三葉一心期葉片的cDNA為模板，檢測TaDCC1-2A、TaDCC1-2B、TaDCC1-2D基因在小麥葉片中的表達量，發(fā)現(xiàn)三者表達量未表現(xiàn)出顯著差異，說明三者在小麥中表達相對穩(wěn)定。

M.D2000 Maker；1.目的條帶 Target band；2.陰性對照 Negative control

圖2 PCR鑒定表達載體陽性克隆
Fig.2 PCR identification of positive
clones in expression vector

圖3 TaDCC1基因表達量分析Fig.3 Expression analysis of TaDCC1 genes

2.3 TaDCC1-2B基因編碼蛋白的生物信息學 分析

2.3.1 基本理化性質(zhì)分析TaDCC1-2B基因開放閱讀框全長為645 bp，編碼214個氨基酸，ProtParam預測顯示所編碼的蛋白分子式為C1031H1634N302O307S13，分子質(zhì)量為23.59 ku，理論等電點(pI)為8.94，脂肪系數(shù)71.31，親水性總平均值-0.409，不穩(wěn)定系數(shù)為56.74(>40)，為不穩(wěn)定蛋白。

2.3.2 蛋白的結構預測 蛋白質(zhì)二級結構預測工具PredictProtein預測該蛋白二級結構中無規(guī)則卷曲占59.35%，螺旋結構有32.24%，片層結構有8.41%，無規(guī)則卷曲是其主要結構元件。利用ProtScale對該蛋白進行親水/疏水性分析，ProtScale Score<0，推測此蛋白是親水性蛋白(圖4)。利用SWISS-MODEL數(shù)據(jù)庫采用同源建模的方法析此蛋白，得到三維結構圖(圖5)。

2.3.3TaDCC1-2B基因的氨基酸序列多重比對及進化分析 利用DNAMAN6.0將小麥TaDCC1-2A、TaDCC1-2B、TaDCC1-2D蛋白的氨基酸序列與擬南芥(AT5G50100)、粗山羊草(AET2Gv21183600)、烏拉爾圖小麥(TRIUR3_12911)、大麥(HORVU2Hr1G118360)、野生二粒小麥(TRIDC2BG082500)、二穗短柄草(BRADI_5g25506v3)、玉米(Zm00001d001910)、水稻(Os04t0668800)的氨基酸序列進行多重比對。結果表明小麥TaDCC1蛋白序列與其他物種序列類似，氨基酸N端列都包含有一個保守的DxxCxxC基序和一個完整的DUF393結構域(圖6)。說明DCC1蛋白在不同物種進化過程中具有一定的保守性。

為進一步研究DCC1基因的進化關系，根據(jù)小麥TaDCC1基因的氨基酸序列，在NCBI網(wǎng)站比對得到其他物種的DCC1基因的氨基酸序列，與小麥TaDCC1氨基酸序列一起用MEGA7.0構建進化樹(圖7)，可以看出小麥基因TaDCC1-2A與TaDCC1-2B聚為一支，且與烏拉爾圖小麥及二粒小麥同源度相對較高；而小麥基因TaDCC1-2D與小麥基因TaDCC1-2A及TaDCC1-2B發(fā)生分化，并與粗山羊草聚在一支。這與小麥A基因組來自于烏拉爾圖小麥，D染色體組來源于粗山羊草的研究結果相吻合。進化分析表明，普通小麥TaDCC13個基因拷貝和野生二粒小麥、烏拉爾圖小麥、粗山羊草在進化上相對保守；而與玉米、水稻、短柄草等單子葉作物屬于遺傳較遠的分支；與擬南芥等雙子葉植物遺傳距離最遠。普通小麥TaDCC13個基因拷貝與親緣關系近的物種間同源性最高，即使親緣關系較遠的物種間也具有一定的同源性。

橫坐標表示編碼蛋白的氨基酸位置順序 The abscissa represents the sequence of amino acid position of coding protein；縱坐標代表親水性得分 The vertical axis represents the score of hydrophilicity

圖4 TaDCC1-2B蛋白的親水性分析
Fig.4 Hydrophility analysis of TaDCC1-2B protein

圖5 TaDCC1-2B蛋白的三維結構預測Fig.5 Predicted three-dimensional structure of TaDCC1-2B protein

圖6 TaDCC1與其他物種同源蛋白的多重序列比對Fig.6 Multi-alignment of TaDCC1 amin oacid sequences with other DCC1s

圖7 小麥與其他物種DCC1蛋白的進化分析Fig.7 Phylogene trees of DCC1 proteins from wheat and other species

2.4 啟動子區(qū)域分析

啟動子分析結果表明(表3)：啟動子序列中含有大量與啟動子增強轉錄效率相關TATA-box和CAAT-box啟動子基本元件，此外還含有許多參與光響應、茉莉酸甲酯應答以及功能未知的順式作用調(diào)節(jié)元件。從響應植物激素的順式作用元件來看，推測該基因可與赤霉素信號調(diào)節(jié)有關，同時也預測該基因啟動子參與分生組織的 表達。

2.5 轉 TaDCC1-2B基因擬南芥植株的篩選及鑒定

為了研究TaDCC1-2B基因的功能，將過表達載體轉化擬南芥突變體dcc1，對收獲的轉基因T0代種子繼續(xù)種植、篩選及鑒定(圖8)，得到轉基因T3代株系并收獲種子，用于后續(xù)試驗。

M.D2000 Marker；1.陰性對照 Negative control；2.陽性對照 Positive control；3-5.轉基因擬南芥 TransgenicArabidopsis

圖8 轉基因擬南芥的PCR鑒定
Fig.8 PCR detection of transgenicArabidopsisthaliana

2.6 TaDCC1-2B基因以及WUS基因的表達分析

為了檢測TaDCC1-2B基因在轉基因擬南芥中的表達水平，提取轉基因T3代在SIM培養(yǎng)25 d的再生芽RNA，以TUB2為內(nèi)參基因，進行實時定量PCR(qRT-PCR)。結果顯示(圖9)轉基因T3代株系的再生芽中TaDCC1-2B基因呈現(xiàn)較高的表達量水平。同時，采取同樣的方法對Col-0、dcc1和T3代轉基因株系的再生芽標記基因WUS的表達量進行測定，結果表明(圖10)Col及T3的WUS表達量極顯著高于dcc1(P< 0.01)，且T3的WUS表達量接近于Col-0。

2.7 轉 TaDCC1-2B基因擬南芥表型鑒定

由圖11觀察到轉基因株系再生芽表型得到了一定程度的恢復，接近于野生型。統(tǒng)計 Col-0、dcc1、T3代株系根尖誘導的愈傷組織在SIM培養(yǎng)第25天的芽再生率(圖12)，dcc1只有31.3%，而野生型Col-0 的芽再生率達到86.7%，顯著高于dcc1(P<0.01)，轉基因T3代植株的芽再生能力達到57.6%，顯著高于dcc1(P<0.05)。

圖9 TaDCC1-2B基因表達分析Fig.9 Quantitative real time analysis of TaDCC1-2B expression

不同字母表示在0.05水平上顯著：下同 Different letters indicate significant differencesat the 0.05 level;The same below.

圖10WUS基因表達分析
Fig.10 Quantitative real time analysis
ofWUSexpression

圖11 在SIM培養(yǎng)第25天的再生芽Fig.11 The regeneration buds cultured in SIM medium for 25 days

圖12 芽再生頻率統(tǒng)計分析Fig.12 Statistical analysis of shoot regeneration frequencies

3 討 論

目前，在多種植物中已發(fā)現(xiàn)和克隆了許多對體外培養(yǎng)再生過程有重要影響的基因，并通過在模式物種中的研究，確定了這些候選基因的功能，并對目標物種進行轉基因從而提高這些物種的再生能力[2]。小麥是中國第三大糧食作物，但在提高小麥體外再生能力的研究上，尚處于對體外再生培養(yǎng)方法的優(yōu)化和控制再生性狀基因的QTL定位上[37]。普通小麥是一個異源六倍體物種，基因組龐大且復雜，由A、B、D 3個序列高度同源的亞基因組組成[38]。本研究用擬南芥硫氧還蛋白DCC1基因同源克隆到小麥中3條高度同源基因序列，通過檢測TaDCC1基因在小麥組織中的的表達量分析3個拷貝基因表達量未表現(xiàn)出顯著差異(圖3)，說明3個基因功能相對保守。由于TaDCC1-2B基因氨基酸序列與擬南芥硫氧還蛋白DCC1同源度最高，因此選取TaDCC1-2B目的基因作為研究對象。通過對TaDCC1-2B基因進行生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)TaDCC1-2B蛋白N端的DxxCxxC基序中具有2個Cys殘基，推測此蛋白具有調(diào)節(jié)硫醇-二硫鍵交換方面的功能，這與前人報道的擬南芥DCC1蛋白結構相似[39-40]。通過進化分析發(fā)現(xiàn)該蛋白與粗山羊草、烏拉爾圖小麥、野生二粒小麥、大麥等單子葉植物的DCC1蛋白同源性較高，但與模式植物擬南芥相比，同源性相對較低，說明二者蛋白之間差異較大，推測它們在功能上也可能因此存在差異，需要進一步鑒定TaDCC1-2B基因的再生功能。

硫氧還蛋白作為抗氧化系統(tǒng)的新型抗氧化酶，在線粒體抵抗氧化脅迫過程中起關鍵作用[41-42]。在大麥中轉入外源硫氧還蛋白基因可提高大麥的抗氧化酶活性，對清除多余的ROS具有積極作用[43]。已有研究報道擬南芥硫氧還蛋白DCC1通過氧化還原修飾調(diào)節(jié)愈傷組織線粒體內(nèi)ROS的穩(wěn)態(tài)從而調(diào)控植物再生[34]，這預示著TaDCC1-2B基因在小麥再生能力方面可能也起著相似的作用。鑒于小麥的遺傳轉化周期較長，本研究首先利用模式植物擬南芥對TaDCC1-2B基因的功能進行了初步研究。在擬南芥突變體 dcc1中過量表達小麥TaDCC1-2B基因后，轉基因株系T3代中TaDCC1-2B基因的表達水平顯著高于Col-0和dcc1植株(圖9)。此外，通過組織培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，轉基因T3植株的再生性狀得到一定恢復(圖11)。Col-0和轉基因T3芽的再生率相對dcc1分別達到極顯著(P<0.01)和顯著水平(P<0.05)(圖12)，表明TaDCC1-2B基因在擬南芥根尖再生成芽的過程中發(fā)揮著重要作用。

基因WUS是WOX轉錄因子家族中研究最為清楚地一個基因，該基因在擬南芥莖頂端分生組織中特異表達，負責調(diào)控莖端分生組織干細胞的形成和維持，并通過與CLV3基因形成一個反饋調(diào)節(jié)環(huán)來調(diào)控莖頂端分生組織中器官的啟動與分生細胞的維持[44]，因此WUS可作為再生芽的標記基因。對比在SIM培養(yǎng)25 d的再生芽體內(nèi)WUS基因的表達水平發(fā)現(xiàn)，WUS的表達量在Col-0 和T3體內(nèi)顯著高于dcc1，在Col-0 和T3兩者之間差異不顯著(圖10)。研究報道擬南芥硫氧還蛋白DCC1的突變會導致線粒體內(nèi)ROS含量增加，激增的ROS導致愈傷組織和芽分生組織形成的主基因表達受到抑制，而將擬南芥DCC1過表達載體轉入突變體中，其再生率顯著提高，接近野生型再生水平[34]。因此推測試驗中轉基因T3株系由于TaDCC1-2B基因的過量表達，使ROS水平保持穩(wěn)態(tài)，WUS基因得以正常表達，從而保持了正常的再生能力。

本研究通過同源克隆得到一個小麥硫氧還蛋白基因TaDCC1-2B，并對其進行生物信息學分析和初步的功能驗證，結果表明TaDCC1-2B基因能夠提高轉基因擬南芥的再生能力。同時應注意到，小麥遺傳背景復雜，調(diào)控體外體細胞胚胎發(fā)生的主效基因可能不同，從與親緣關系較遠的擬南芥中克隆的再生基因并不一定能提高小麥的再生能力，需要對其在小麥組織培養(yǎng)實踐中進一步驗證。

4 結 論

本研究用同源克隆的方法從小麥品種‘中國春’中克隆得到一個小麥硫氧還蛋白基因TaDCC1-2B，對其進行了生物信息學分析和初步的功能驗證。結果發(fā)現(xiàn)該基因含645 bp的開放閱讀框，編碼214個氨基酸，氨基酸序列存在一個包含DxxCxxC基序的DUF393結構域，系統(tǒng)進化分析表明發(fā)該基因具有較強的保守性。另外，將TaDCC1-2B基因轉入擬南芥突變體dcc1中，獲得的轉基因株系的再生能力得到顯著提高，接近恢復到野生型水平，表明該基因在擬南芥根尖再生成芽的過程中發(fā)揮著重要作用，可能在小麥的再生過程中也將發(fā)揮相似作用。