不同病情程度慢性乙型肝炎患者血清Treg/Th17水平變化及臨床意義

金 剛，王建芳

（1.武陟濟民醫院 檢驗科，河南 焦作 454950；2.駐馬店市中心醫院 檢驗科，河南 駐馬店 463000）

慢性乙型肝炎（CHB）為臨床多發疾病類型，乙型肝炎病毒（HBV）所致肝損傷與轉歸情況和機體細胞免疫間具有密切相關性，主要為T淋巴細胞清除病毒及肝細胞損傷，效應CD4+T淋巴細胞為機體免疫應答重要部分，于免疫調節中具有關鍵作用[1]。隨生物學及免疫學技術不斷發展，CD4+T淋巴細胞另外兩個亞群輔助性T淋巴細胞17（Th17） 及調節性T細胞 （Treg） 在CHB患者中的促炎及抗炎作用得到證實[2]。Treg細胞約占正常機體外周血CD4+T細胞總數目的5%～10%，主要功能為維持自身免疫耐受及調節自身T細胞功能，其活化后可分泌IL-10、TGF-β1及其他可溶性細胞因子，并通過對樹狀突細胞成熟予以抑制及細胞間直接接觸而發揮免疫抑制功能。Th17則可分泌IL-17等，其中IL-17為主要效應因子，可促使樹狀突細胞成熟、T細胞活化等，以此參與宿主抗感染免疫，還可增加基質金屬蛋白酶、趨化因子及促炎因子等含量，引發組織細胞浸潤等。Treg/Th17比值紊亂為多種腫瘤、自身免疫病變及炎性疾病發生的重要原因，基于此，本研究選取我院116例CHB患者，探討不同病情程度患者間血清Treg/Th17水平及其意義，現報告如下。

資料與方法 一、一般資料 選取我院2017年11月-2018年12月CHB患者116例設為研究組，另選取同期于我院進行健康體檢者116例設為對照組。研究組男82例，女34例；年齡23～63歲，平均（57.20±7.69） 歲；病情程度：輕中度77例，重度39例。對照組男79例，女37例；年齡21～66歲，平均（56.91±7.92） 歲。2組性別、年齡等臨床資料均衡可比（P＞0.05）。

二、選取標準 1.納入標準 ⑴研究組符合CHB及病情程度診斷標準[3]；⑵對照組抗HIV抗體試驗、丙肝抗體等檢查均呈陰性，且無肝炎癥狀；⑶知曉本研究，簽署同意書。

2.排除標準 ⑴合并惡性腫瘤者；⑵妊娠期及哺乳期女性；⑶合并脂肪性肝炎、酒精性肝炎及藥物性肝炎者；⑷合并血液系統、內分泌系統、自身免疫系統重度病變者；⑸合并其他全身性重度感染性疾病者。

方 法 設備選取FACSCalibur流式細胞儀、AU5800型全自動生化分析儀、淋巴細胞分離液、FoxP3試劑盒（含有配套固定/透膜劑） 與PE所標記抗人FoxP3抗體和對應同型對照、IL-17檢測所用固定/透膜劑、PE所標記抗人IL-17抗體和對應同型對照、莫能霉素、離子霉素、佛波脂，胎牛血清、RPM I 1640；抽取所有受檢者空腹靜脈血4m L，經肝素抗凝，以淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞，分選CD4+T細胞，制為懸液（細胞濃度：1×107/m L）；取100μL所選CD4+T細胞液置于流式試管，加新鮮配置固定/透膜劑（1m L），于4℃條件下避光反應60m in，經透膜緩沖液洗滌、重懸，將其分別放入2個試管內，各加入FoxP3-PE與對應同型對照IgG1-PE 10μL，于室溫條件下避光反應30m in，洗滌3次，經PBS 300μL重懸細胞，測定 Treg百分比；取100μL所選CD4+T細胞液懸浮于900μL RPM I 1640培養液，加入2umol/L莫能霉素、1ug/m L離子霉素、50 ng/m L佛波脂，置于5%二氧化碳、37℃環境內培育5h，取100μL置于專用流式試管，加入固定/透膜劑A100μL，于室溫條件下避光反應15min，洗滌1次，加入固定/透膜劑B100μL，于室溫條件下避光反應5m in，將其分為2管，加入IL-17 PE與對應同型對照IgG1-PE，于室溫條件下避光反應30m in，洗滌2次，經PBS 300μL重懸細胞，測定Th17百分比。

四、觀察指標 ⑴統計分析研究組與對照組Treg及Th17百分比、Treg/Th17。⑵統計分析研究組不同病情程度患者Treg及Th17百分比、Treg/Th17。⑶統計分析 Treg及 Th17百分比、Treg/Th17與CHB病情程度相關性。

五、統計學方法 通過SPSS18.0對數據進行分析，計量資料（±s）表示，t檢驗，Treg及Th17百分比、Treg/Th17與CHB病情程度相關性以Pearson予以分析，P＜0.05表示差異有統計學意義。

結 果 一、研究組與對照組各指標水平比較研究組Treg及Th17百分比高于對照組，Treg/Th17低于對照組（P＜0.05），見表1。

二、不同病情程度CHB患者各指標水平比較 重度CHB患者Treg及Th17百分比高于輕中度患者，Treg/Th17低于輕中度患者（P＜0.05），見表2。

三、各指標水平與CHB病情程度相關性分析 Pearson檢驗可知，Treg及Th17百分比與CHB病情程度間存在明顯正相關關系（P＜0.05），Treg/Th17與CHB病情程度間存在明顯負相關關系（P＜0.05），見表3。

討 論 CHB發病及進展和轉歸為肝細胞、HBV和宿主免疫系統互相作用的動態平衡過程，研究指出，HBV侵襲機體肝細胞后發生復制，分泌的抗原引起機體免疫應答，Th17細胞及Treg細胞等免疫因子在上述過程中均有重要作用[4]。

近些年，Th17及Treg細胞于自身免疫性病變及炎癥中的重要作用得到普遍重視，Treg細胞屬CD4+T細胞亞群，主要功能為調節控制病原體T細胞反應及造成重度炎癥、組織破壞的過度T細胞反應間平衡；Th17為臨床新發現的CD4+T細胞亞型，具備IL-23依賴性生成IL-17等特征，促炎癥作用較強，在多種慢性炎癥、自身免疫病變發生與進展中具有重要作用[5]。Th17細胞及Treg細胞間相互作用較復雜，Th17及Treg與其所分泌細胞因子間構成一個網絡，給予所需細胞因子后，可出現Th17及Treg細胞分化偏離，進而對兩者數目、功能平衡產生影響。IL-2為關鍵分子，經信號轉導及轉錄激活因子5途徑，對Th17細胞分化予以抑制、對Treg細胞生成予以促進，而IL-21可影響Foxp3表達，阻止Treg細胞生成產生抑制作用，并經自分泌途徑促使Th17發育及其與Treg細胞間平衡。同時，Th17及Treg細胞分別起促炎及抑制作用，兩者間平衡發生紊亂為腫瘤及自身免疫病變等發生及進展的重要因素。

本研究結果表明，研究組Treg及Th17百分比高于對照組，Treg/Th17低于對照組（P＜0.05），主要是因Treg及Th17數目雖增高，但Treg細胞增多速度低于Th17細胞，故致使Treg/Th17降低，表明CHB患者機體處于Th17細胞增多狀態，且趨于優勢地位的Treg/Th17免疫失衡，推測Treg細胞增殖及功能不足、Th17細胞異常活化均可能為肝臟炎癥反應發生與進展的重要因素。此外，黃進發等[6]研究指出，Treg和Th17的發育情況為特定核轉錄因子RORγt、Foxp3所決定，其中Foxp3為Treg特異性標志物，可調節Treg發育和功能，可對自身反應性T淋巴細胞增殖及活化予以主動抑制，以此控制T淋巴細胞對異體抗原或自身抗原過度反應；RORγt為調節Th17分化的重要轉錄因子，可對T淋巴細胞分化為Th17產生誘導作用，而其研究結果顯示，CHB患者 RORγt、Foxp3表達高于對照組。另由本研究結果顯示，不同CHB患者間Treg及Th17表達情況、Treg/Th17間存在顯著差異，且Treg及Th17百分比與CHB病情程度存在正相關關系，Treg/Th17與其存在負相關關系（P＜0.05），提示隨CHB患者病情加劇，Treg及Th17百分比持續增高，Treg/Th17比值呈降低趨勢，臨床可通過測定其表達情況評估CHB患者病情程度，據此制定、調整治療方案，確保治療有效性及合理性。

表1 研究組與對照組各指標水平比較（±s）

表1 研究組與對照組各指標水平比較（±s）

組別 例數 Treg（%） Th17（%） Treg/Th17研究組 116 7.27±0.51 2.13±0.10 3.41±0.39對照組 116 5.59±0.54 0.51±0.08 10.96±0.44 t值 24.361 136.246 138.301 P值 0.000 0.000 0.000

表2 不同病情程度CHB患者各指標水平比較（±s）

表2 不同病情程度CHB患者各指標水平比較（±s）

病情程度 例數 Treg（%） Th17（%） Treg/Th17輕中度 77 6.69±0.49 1.38±0.08 4.85±0.43重度 39 7.81±0.50 2.87±0.11 2.72±0.38 t值 11.551 83.214 26.177 P值 0.000 0.000 0.000

表3 各指標水平與CHB病情程度相關性分析（n=116）

綜上所述，CHB患者Th17及Treg百分比異常增高、Treg/Th17顯著降低，且在不同病情程度患者間存在明顯差異，Treg及Th17百分比與CHB病情程度間存在明顯正相關關系，Treg/Th17與CHB病情程度間存在明顯負相關關系，可為臨床治療方案的制定提供參考依據。