survivin基因表達與胃癌患者對奧沙利鉑耐藥的關系分析

國 強 白雪峰 周勇慧

胃癌始終是危害我國居民身心健康的常見惡性腫瘤。目前，普外科手術是治療早期胃癌的重要手段，但其難以控制殘留的癌細胞局部再生長，且臨床中多數患者確診時已為進展期胃癌，接受普外科手術治療同時往往需輔以化療、放療等其他綜合性治療手段，尤其是化療已經成為多數進展期胃癌患者治療必不可少的環節[1]。作為新型的第三代鉑類化療藥物，近年來奧沙利鉑治療進展期胃癌的良好效果已取得廣泛關注，但腫瘤多藥耐藥性的存在成為了阻礙奧沙利鉑化療效果的重要因素[2]。迄今為止，胃癌的多藥耐藥性機制尚未完全明確。Survivin是凋亡抑制蛋白家族的成員之一，既往研究[3-4]發現其能夠促進血管生成，影響多種腫瘤的病理特征，也與耐藥形成有關。因此，明確胃癌組織survivin基因表達與奧沙利鉑耐藥性的關系對預測患者化療效果有重要意義。

1 材料與方法

1.1 臨床標本

原發性胃癌標本來源于2016年6月至2018年3月經包頭市腫瘤醫院病理確診且行普外科手術切除的80例胃癌患者，其中有36例取得距離癌組織邊界>3 cm的癌旁組織標本(術后證實無腫瘤細胞存在)；所有標本均經甲醛固定，常規石蠟包埋、切片，然后經蘇木精-伊紅染色進行病理診斷。所有患者的病理標本檢查明確診斷為腺癌，并符合中華人民共和國衛生部制定的《中華人民共和國衛生行業標準：胃癌診斷標準(WS 316-2010)》[5]中相關診斷標準，術前未接受任何身體耐受相關藥物化療，未合并其他惡性腫瘤，臨床各項資料完善。80例中，男性51例(63.75%)，女性29例(36.25%)，年齡36～69歲，平均(54.08±10.14)歲，其中賁門癌、胃體癌、胃竇癌分別為35例、35例、10例。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器、藥物及試劑 封片機購自德國Leica公司；離心機購自美國波德BIRD公司；顯微鏡購自日本NIKON公司。奧沙利鉑購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司；Survivin兔抗人多克隆抗體購自美國Zymed公司；SP免疫組織化學染色試劑盒、加強型二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑購自福州邁新生物技術開發公司。

1.2.2 免疫組化染色及結果判定 采用免疫組化染色SP法。用磷酸鹽緩沖洗液(PBS)代替一抗作陰性對照，用已知陽性胃癌切片作為陽性對照，采用兩步法進行，依次加一抗、加二抗進行孵化，最后以DAB顯色，蘇木精復染，進行相應處理后封片，于10×40倍光鏡下觀察10個陽性細胞較多的視野，每個視野計數100個細胞。免疫組化染色陽性反應為明顯高于背景染色的黃-棕色顆粒，由高年資病理科醫師以雙盲法進行判斷。以半定量積分方法記錄survivin基因表達結果，根據免疫組化染色反應的深度及染色陽性細胞占觀察的腫瘤細胞的百分比計分，兩項指標分值的乘積分為4級：0～1分為陰性(-)，2～4分為弱陽性(+)，5～8分為陽性(++)，9～12分為強陽性(+++)。

1.2.3 腫瘤細胞懸液制備及MTT藥物敏感試驗 取瘤體無壞死部位置于Hanks液無菌小瓶，PBS反復沖洗后剪成糊狀，銅網過濾，1 000 r/min離心5 min，去上清，Hanks液漂洗，10%胎牛血清RPMI-1640培養液重懸，以0.4%臺盼藍染液計數，調整單細胞懸液至活細胞濃度3×105/ml。取單細胞懸液加入96孔培養板，每孔180 μl。用藥組加入藥物終濃度為10倍血漿峰值濃度的奧沙利鉑，設3個復孔；對照組不加藥物；空白組無培養細胞。置CO2培養箱中，37 ℃培養48 h，各孔加入5 mg/ml的噻唑藍(MTT)10 μl，繼續培養4 h。以酶標儀在570 nm波長處檢測吸光度(A)值。取3孔A值的平均值作為最終A值。腫瘤細胞抑制率=(對照組A值-用藥組平均A值)/(對照組A值-空白組A值)×100%。判定標準：腫瘤細胞抑制率<30%為耐藥，30%～50%、>50%分別為中度敏感、高度敏感。

1.3 統計學方法

應用統計學軟件SPSS 19.0分析和處理研究數據，其中survivin基因表達情況、原發性胃癌的病理特征、奧沙利鉑的耐藥性等計數資料采取率(%)表示，組間對比進行χ2檢驗，等級資料采用秩和檢驗，原發性胃癌survivin基因表達與奧沙利鉑耐藥性的關系采用Spearman相關性分析；以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 survivin基因表達情況

Survivin陽性著色位于細胞質(多見于胞質)。原發性胃癌標本中，survivin基因陽性表達率為68.75%，癌旁組織標本陽性表達率為11.11%，差異有統計學意義(χ2=33.003，P<0.05)，見表1。

表1 原發性胃癌、癌旁組織標本中survivin基因表達情況(例，%)

2.2 survivin基因表達與原發性胃癌病理特征的關系

Ⅲ～Ⅳ期、發生淋巴結轉移的原發性胃癌患者癌組織survivin基因陽性表達率明顯高于Ⅰ～Ⅱ期、未發生淋巴結轉移的患者，比較有統計學意義(P<0.05)；不同性別、年齡、解剖位置的患者癌組織survivin基因表達情況比較無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 survivin基因表達與胃癌病理特征的關系(例，%)

2.3 原發性胃癌survivin基因表達與奧沙利鉑耐藥性的關系

本組80例原發性胃癌組織對奧沙利鉑耐藥者22例，達27.50%；隨著survivin基因表達強度的增強，奧沙利鉑耐藥率逐漸增高，敏感性逐漸下降，差異經秩和檢驗有統計學意義(Z=12.051，P<0.05)；Spearman相關性分析顯示原發性胃癌survivin基因表達與奧沙利鉑耐藥率呈正相關(γ=0.447，P<0.05)。見表3。

表3 原發性胃癌survivin基因表達與奧沙利鉑耐藥性的關系/例

3 討論

作為凋亡抑制蛋白家族中1個結構獨特的新成員，survivin具有抑制細胞凋亡，促進細胞增殖的作用。已有大量文獻[6-8]證實survivin基因在多種惡性腫瘤細胞質中表達，如肺癌、卵巢癌、膀胱癌、結直腸癌等，具有腫瘤特異性表達的特點。有報道[9]發現survivin是G2/M期的調節基因，其表達水平與細胞周期密切相關，繼而可參與細胞周期調控、有絲分裂及腫瘤的惡性轉化。潘存偉等[10]的報道顯示，survivin基因表達與腫瘤分化程度、胃癌局部浸潤、淋巴結轉移及TNM分期有關，并與微血管密度(MVD)具有明顯的相關性，由此認為的過度表達是胃癌發生過程中的早期事件，并證實survivin基因能夠促進胃癌血管形成。本研究結果顯示，Survivin陽性著色位于細胞質，原發性胃癌標本中survivin基因陽性表達率明顯高于癌旁組織中陽性表達率(68.75% vs 11.11%)；且Ⅲ～Ⅳ期、發生淋巴結轉移的原發性胃癌患者癌組織survivin基因陽性表達率明顯高于Ⅰ～Ⅱ期、未發生淋巴結轉移者。以進一步表明胃癌組織中survivin基因表達水平高，且可反映其病理特征，與上述報道具有一致性。

更值得關注的是，本組80例原發性胃癌標本對奧沙利鉑耐藥者22例，達27.50%，隨著survivin基因表達強度的增加，奧沙利鉑耐藥率逐漸增加，敏感性逐漸下降。Spearman相關性分析結果證實原發性胃癌survivin基因表達與奧沙利鉑耐藥率呈正相關，即胃癌組織中survivin基因表達與奧沙利鉑耐藥性密切相關。謝麗等[11]在關于胃癌藥物敏感度的研究中發現Survivin mRNA表達用于判斷奧沙利鉑敏感度的準確率為70%，與本文觀點類似。目前，腫瘤多藥耐藥的作用機制非常復雜，臨床已明確的可能機制主要包括[12-13]：①細胞微環境發生改變；②膜轉運蛋白介導的藥物外排及改變細胞內藥物濃度；③拓撲異構酶II等相關解毒酶的表達異常；④細胞凋亡途徑與增殖分化異常。survivin基因為目前為止已知的抑制細胞凋亡能力最強的因子，我們認為，survivin基因影響奧沙利鉑耐藥性的原因與其抑制細胞凋亡能力密切相關，由于其能夠抑制細胞凋亡的發生，繼而可促進細胞的有絲分裂和加快新生血管生成，繼而參與調節腫瘤細胞的耐藥性。周露婷等[14]前期報道對survivin基因影響胃癌細胞耐藥性有不同的解釋，即survivin表達高的癌細胞對某些化療藥物不敏感，或者化療本身誘發了survivin的表達，繼而增加了腫瘤細胞的生存力。賈楠等[15]則與本文持類似一致，認為survivin屬于腫瘤特異性凋亡抑制因子，可通過增強胃癌細胞的凋亡抵抗能力而導致胃癌細胞對鉑類藥物產生耐藥。造成這種差異的原因可能為不同研究探討的化療藥物不同或患者存在個體化差異，可見survivin基因對包括奧沙利鉑在內的化療藥物耐藥性的影響尚需進一步探討。

綜上，胃癌組織survivin基因表達與奧沙利鉑耐藥性相關，抑制survivin基因表達有可能逆轉化療抵抗，有望為提高胃癌化療療效提供新的方向。