特異性表達Her-2抗原樹突狀細胞疫苗治療非小細胞性肺癌體外抗瘤效應的研究

鈄方芳 簡 艷 郭善嫻 蔡 云 陳小丹 郭昌瑩

肺癌是中國乃至全世界腫瘤發病率和死亡率最高的癌種[1]，手術和放化療是其傳統的治療模式，但5年生存率不足15%[2]。靶向治療的出現使肺癌的5年生存率提高至17%以上[3]。多數患者就診時即為中晚期。放化療及靶向治療不僅能殺傷癌細胞，對機體正常細胞和免疫系統也有一定的損害。近年來，隨著分子生物技術的發展和基因工程技術的進步，免疫治療取得重大突破，尤其是免疫檢查點抑制劑(PD-1)的上市，顯著提高晚期肺癌的生存期[4]，提取患者外周血培養DC疫苗和細胞因子誘導殺傷細胞(cytokine induce killer,CIK)免疫治療出現的副反應輕微，療效可，是值得深入探索的重要治療方案，尤其是晚期體質欠佳肺癌患者的解救措施[5]。

本研究從細胞和分子水平研究癌基因的腫瘤抗原性，在目前成熟技術的DC疫苗免疫治療基礎上，將Her-2基因通過慢病毒載體方式轉染重組DC基因組，使其持續在DCs中表達，探索其對淋巴細胞的激活功能及對Her-2陽性肺癌細胞株的免疫抗腫瘤效果，改善DC疫苗抗腫瘤治療的瓶頸問題，為進一步探索新的高效的腫瘤治療方式奠定充分的理論和實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 質粒、菌株和癌株

pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro、pMD2.G、pMDL-G/P-RRE、pRSV-REV(Biocat公司)；pcDNA3.1-ERBB2-EGFP(香港中文大學生物醫學院贈)；人胚腎細胞株293FT、大腸桿菌Top 10(香港中文大學生物醫學院贈)，細胞株(A549肺腺癌、H460大細胞肺癌、H1299肺腺癌、H441肺腺癌，H2170肺鱗癌，HCC827非小細胞肺癌，均由本實驗室保存)。

1.2 試劑

限制性內切酶NotI、XbaI、T4 DNA連接酶、ExTaq DNA聚合酶(TaKaRa公司)；DNA凝膠回收試劑盒(QIAGEN公司)；DNA marker、PCR試劑盒、質粒快速提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒(天根公司)；IL-2(雙鷺公司)；IFN-γ(華新公司)；CD3(Biolegend)；GM-CSF、IL-4、TNF-α(Peprotech)； CerBb-2兔單克隆抗體(福州邁新)；CD83 APC、CD86 FITC、HLA-DR PERCP、CD1α PE、CD3 FITC、CD56 PE(BD Biosciences)；CCK8試劑盒(南京建成)。

1.3 ERBB2慢病毒載體構建及其表達

根據Her-2基因片段設計引物，上游引物1：5'GAAGATTCTAGAATGGAGCTGGCGGCCTTG3'，在5'端引入Xba I酶切位點和保護堿基；下游引物2：5'GAAGGAGCGGCCGCCCTCACACTGGCACGTCCAGA3'，在5'端引入Not I酶切位點和保護堿基；ERBB2長度：3768 bp。PCR條件設置為：94 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，68 ℃延伸4 min 30 s，循環32個周期，擴增ERBB-2基因片段，瓊脂凝膠回收試劑盒提取PCR產物，將擴增的Her-2基因片段與慢病毒質粒連接室溫下孵育2.5 h構建慢病毒載體(LV-Her2載體)，熱休克法轉化Top 10感受態菌，收集單克隆菌落后,復蘇Lenti-X-293T細胞，按接種密度5×105個/ml置于15 cm的培養皿中，培養液為含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基。當細胞覆蓋培養皿面積為90%時，以1∶9的比率進行傳代。取2× HBS13.5 ml，0.25MCaCl2溶解液13.5 ml，TE buffer 12.2 ml，包裝質粒pMD 2.0 95 μg，pMDL-G/P-RRE 176 μg，pRSV-REV 68 μg，病毒質粒pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro-Her2 270 μg，渦旋混勻。加入均勻鋪滿約40%的293T中，置于37 ℃，5%CO2培養箱中培養16 h。16 h后更換新的培養液22.5 ml。再次孵育30 h后，收集含病毒的上清液，800 rpm，離心10 min。用0.45 μm的過濾網過濾。同時每400 μl的慢病毒上清液加入100 μl的PEG-itTM配制，1 500 rpm，離心30 min，上清液多次離心收集慢病毒載體。檢測病毒滴度。

1.4 疫苗制備

用含有肝素的抗凝管收集人外周血30 ml， 加入含Ficoll的離心管，反復離心后取單個核細胞的白膜層進行培養，以1.5×106個/ml的接種密度分裝入3個T25培養瓶中，每瓶共有培養基約6 ml，記為A、B、C。置于37 ℃、5%CO2培養箱2 h，向三個培養瓶中分別加入 IL-4，GM-CSF和30 μl血漿作DC培養。第5天分別向B和C加入空載體LV和LV-Her2轉染DC，取MOI=10，病毒劑量=MOI×細胞數/滴度(TU/ml)×1000。第6天加入TNF-α 12 μl，第8天觀察綠色熒光蛋白表達情況，細胞刷刮出細胞，1 200 rpm，離心5 min，計數：0.6×106個/ml，流式細胞學測三組培養瓶中細胞的CD83/86/1α和HLA-DR的表達情況，評估DC疫苗的成功率。

CIK疫苗制備：計數新培養瓶A1，B1，C1細胞數為：0.9×106個/ml，同時加入IFN-γ，CD3pure、血漿進行CIK培養。分別隔天計數CIK數量，補液至密度1.5×106個/ml。在CIK培養的第8天加入DC對照組疫苗、LV-DC空載體組疫苗、LV-Her2-DC實驗組疫苗(計數CIK∶DC為10∶1)，進行DC-CIK疫苗培養，第14天收集CIK，取少量CIK調整密度為105個/ml，流式細胞儀測三組細胞表面CD3/56表達情況，評估CIK疫苗的成功率。

1.5 淋巴細胞增殖反應

將三組DC疫苗誘導的CIK分別接種于96孔板中，每孔105個細胞，培養液為100 μl/孔，設置6復孔，放于細胞培養箱中48 h。每孔加入10%總體積的CCK8試劑，置于培養箱內4 h，450 nm波長下測量OD值。評估三組DC疫苗誘導淋巴細胞增殖能力。

1.6 免疫組化篩選表達Her-2的肺癌細胞株

將已消毒好的玻片放置在10 cm的培養皿中，培養實驗室保存的A549肺腺癌、H460大細胞肺癌、H1299肺腺癌、H441肺腺癌，H2170肺鱗癌，HCC827非小細胞肺癌細胞株，按接種密度為2×105個/ml進行細胞爬片，細胞培養箱內培養48 h。免疫組化法評估各個細胞株Her-2表達能力。篩選Her-2表達能力最強的細胞株進行殺傷實驗。

1.7 DC-CIK殺傷肺癌細胞的效率

將篩選出表達Her-2的A549肺癌細胞接種在96孔板中，每孔數量為：5×103個，培養液體積為：100 μl，培養箱內培養24 h。按效靶比分別為10∶1、20∶1、40∶1的比率加入三組DC疫苗誘導的CIK中進行體外殺傷，每組設置3復孔。效靶細胞共培養48 h后，加入10 μl CCK8試劑，繼續培養4 h，450 nm下酶標儀測量每孔的OD值。殺傷率計算公式如下：殺傷率=[1-(效靶實驗孔OD-效應細胞孔OD)/靶細胞孔OD]×100%。

1.8 統計學分析

應用SPSS 22.0統計軟件分析數據，t檢驗對比實驗組與對照組之間的差異，隨機區組方差分析比較多組變量之間的差異，定義P<0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 Her-2基因克隆PCR結果

利用PCR成功擴增出pcDNA3.1-ERBB2-EGFP質粒中需要的ERBB2基因片段(圖1)

M為DNAladder；PCR為加入引物擴增后的產物；Con為原始質粒。

2.2 感受態菌落中重組質粒Her-2基因鑒定

電泳可見感受態菌落中有含Her2基因的質粒(見圖2)。

M為DNAladder；PCR為加入引物擴增后的產物；Con為原始質粒。

2.3 病毒滴度測定

隨著稀釋程度的增加，可見熒光顯像細胞數遞減(圖3)。

圖3 熒光顯微鏡下慢病毒感染293T細胞圖像

2.4 DC疫苗、DC-CIK細胞培養

單個核細胞在細胞因子GM-CSF和IL-4誘導下貼壁生長，邊界逐漸不整齊并有小的突起，加入TNF-α后突起明顯，外形如樹突狀形態；在IFN-γ、CD3和IL-2誘導下分化為懸浮生長的CIK，細胞逐漸增大，可見集落，胞膜光滑無突起，胞質內有分泌顆粒。

2.5 慢病毒轉染DC疫苗情況

取MOI=10，空載體病毒和LV-Her2轉染DC效率分別為40.2%和41.8%，無統計學差異(P=0.293)。

2.6 三組DCs表面CD1α/83/86和HLA-DR的流式檢測結果(表1)

表1 三組DC疫苗表面分子表達情況

2.7 三組DC疫苗誘導制備CIK后表面分子CD3/56的流式檢測結果(表2)

表2 三組DC-CIK疫苗表面分子CD3/56的表達情況

2.8 各組DC疫苗刺激CIK增殖結果(表3)

CCK8法檢測CIK增殖情況，發現LV-Her2-DC實驗組誘導CIK增殖明顯增強，明顯高于LV-DC空載體組和單純DC對照組，方差分析發現三組CIK增殖情況并不完全相同(P=0.00)。LV-DC組與單純DC組CIK增殖無明顯差異(P=0.06)，LV-Her2-DC實驗組明顯高于單純DC對照組，有統計學意義(P=0.01)。

表3 三組CIK增殖能力比較

2.9 肺癌細胞株免疫組化結果

顯微鏡下觀察發現：A549肺癌細胞胞膜染色呈弱而不完整的著色，根據Her-2診斷標準，Her-2免疫組化結果為+。余細胞株未見明顯著色。

2.10 CCK8檢測CIK對腫瘤細胞的殺傷率結果

分別將三組DC-CIK加入A549肺癌細胞培養瓶中共培養，鏡下發現DC-CIK體型小且呈圓形，A549貼壁生長，外觀大呈不規則形態，共培養48 h后發現DC-CIK浸潤在A549腫瘤細胞周圍，A549肺癌細胞破裂死亡，且效靶比越高，A549肺癌細胞死亡越明顯。三組DC-CIK在不同效靶比下殺傷率有差異(P=0.003)，其中空載體組與DC-CIK疫苗殺傷效果無統計學差異(P=0.654)，見表4。

表4 三組CIK對A549的殺傷率/%

注：P為不同效靶比下LV-Her2-DC-CIK實驗組與單純DC-CIK對照組對A549腫瘤細胞殺傷能力差異的統計學分析。

3 討論

肺癌細胞表達多種特異性癌抗原，是具有免疫原性的惡性腫瘤[6]。其中，DCs作為機體最強大的抗原專職遞呈細胞，能夠高表達MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ類主要組織相容性復合物，具有免疫刺激能力，能高效激活初始型T細胞，在機體免疫應答反應中起關鍵作用。體外培養DC疫苗回輸體內可彌補腫瘤微環境中免疫系統的抑制，誘發且增強細胞毒性T淋巴細胞殺傷腫瘤，目前已廣泛應用于臨床。除外傳統的單純DC疫苗，還有抗原肽或全腫瘤抗原致敏的DC疫苗，將特異性腫瘤抗原或全腫瘤抗原負載在DCs表面，誘導機體針對某一特定抗原或含有某一抗原物質的細胞進行殺傷[7]。

近年來，多數研究發現腫瘤相關性抗原可作為內源性抗原分子被機體抗原遞呈細胞識別，以Ⅰ類MHC-多肽的形式遞呈至淋巴細胞誘發細胞毒性T淋巴反應(cytotoxic lymphocyte，CTL)或在胞內加工處理后以Ⅱ類MHC-多肽的形式遞呈誘導產生免疫應答。目前已證實的癌基因如K-ras[5]、p53[8-9]、MAGE-A3[10]、CK19[11]等表達蛋白均可誘發機體免疫應答，是潛在的靶向抗原基因。有文獻報道Her-2蛋白在胃癌、乳腺癌和肺癌等多種惡性腫瘤中均有較高表達[12]，其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)組織中Her-2蛋白表達率高達20%～30%[13]，Her-2突變率高達4%左右[14]。曲妥珠單抗可明顯改善乳腺癌和胃癌Her-2高表達患者的生存期，然而對肺癌Her-2陽性患者療效并不佳[15]。從免疫學角度設想，如果增強抗原遞呈細胞對Her-2的捕獲能力，提高CD8+等效應T細胞對Her-2陽性腫瘤的識別和殺傷效果，提高機體對腫瘤細胞的免疫應答反應，從而起到殺傷腫瘤細胞以及清除潛伏轉移病灶的作用。因此，我們以Her-2基因為靶標，通過慢病毒載體導入DC抗原遞呈細胞來增強Her-2的表達量，增強靶抗原的提呈能力，提高機體免疫系統識別能力，從而建立起一條新的針對肺癌驅動基因表達的治療途徑來評估其殺瘤效應。

有學者利用慢病毒載體將MAGE-A3基因重組于DCs中，制作能持續表達MAGE-A3蛋白的DC疫苗，發現其能高效的誘發抗腫瘤免疫應答反應并能殺死表達MAGE-A3癌細胞，進一步支持本研究的可行性[10]。我們通過慢病毒載體將Her-2全基因組整合入慢病毒質粒中，獲取攜帶Her-2基因的慢病毒載體，并轉染DCs制備表達該抗原的DC疫苗。本研究證實，空載體轉染DC與單純DC比較，流式細胞學顯示DCs表面CD1α/83/86和HLA-DR表達無明顯差異(P>0.05)。本研究發現空載體病毒和Her-2慢病毒載體DC轉染效率分別可達到40.2%和41.8%，兩組載體轉染效率無明顯差異(P=0.29)，未見DCs漂浮死亡等現象發生，提示當MOI為10時，慢病毒轉染后DC生長不受影響且攜帶Her-2基因的慢病毒顆粒不降低感染能力，證實Her-2慢病毒載體可有效的感染DCs。同時發現利用基因轉染技術將特異性基因片段重組于DC疫苗基因組可內源性高效持久的表達腫瘤抗原表位，激活CTL免疫應答，且能有效的克服HLA限制，可批量性生產[10]。結合Her-2基因潛在的腫瘤抗原性，我們利用基因工程技術將其整合至DC基因組，制備可持續表達Her-2的DC疫苗，使之能持久高效的表達腫瘤抗原，同時還刺激DC疫苗本身和體內其它DCs的成熟，增強了腫瘤抗原遞呈能力，激活機體建立抗腫瘤免疫應答能力，并重建T細胞免疫功能，為肺癌等多種Her-2陽性的腫瘤患者探索一條新的治療途徑。

臨床上用于被動免疫治療的淋巴細胞主要有：LAK細胞、CIK疫苗、NK細胞和CD3AK細胞等。其中，CIK可同時表達CD3+和CD56+兩種膜蛋白分子，兼具NK細胞非MHC限制性殺瘤和T淋巴細胞的高效抗性特點，同時CIK增殖速度快、抗凋亡和殺瘤能力不受細胞耐藥性影響。有學者發現DCs刺激CIK后的過繼免疫療法明顯比單純的DC疫苗主動免疫治療或單純的CIK過繼免疫治療對腫瘤的殺傷率要高[16]，故本研究選用CIK作為腫瘤殺傷T淋巴細胞。DCs誘導CIK增殖反應結果顯示：Her-2基因修飾的DCs激發CIK增殖活化能力明顯高于單純DCs和空載體DCs(P=0.003)，提示LV-Her2-DC疫苗在體外能有效的誘導淋巴細胞活化增殖。而空載體DCs和單純DCs激發CIK增殖活化相比較并未表現有統計學差異(P=0.654)，進一步證實慢病毒載體不損害DC功能。流式細胞學檢測CIK表型發現均表達CD3/CD56，與多數研究中得到的慢病毒轉染后DCs并不改變DCs及CIK本身功能結果相似，包括不影響DCs和CIK的成熟分化[17-18]。

Her-2蛋白在腫瘤的發生發展中占據重要角色，主要參與肺癌、乳腺癌和胃癌等多種腫瘤的MARK和PI3K信號傳導途徑，因此，本研究以Her-2為靶基因，建立一條新的細胞免疫抗腫瘤途徑。在實驗中Her-2表現出強烈的自體異源性，刺激CIK活化增殖，約為單純DC刺激CIK誘導細胞活化及數量增殖能力的2倍，為殺傷腫瘤細胞打下堅實的基礎。繼曲妥珠單抗有效應用于乳腺癌和胃癌的治療以來，一系列以Her-2為靶點的腫瘤治療策略相繼被建立，包括靶向Her-2抗原肽負載DC的主動免疫治療，我們構建的Her-2慢病毒載體在轉染DCs后，可將Her-2片段重組于DCs基因組內，表達的Her-2蛋白被內源性遞呈誘發CTL反應，同時Her-2的整個cDNA可能含有其它未知的抗原決定簇，同時遞呈識別發揮最大限度的DCs免疫抗原遞呈功能；再次，DCs表面持續表達的Her-2抗原能持續的刺激DCs，克服MHC-抗原肽復合物降解對其產生的損傷。

本研究以弱表達Her-2蛋白的A549肺癌細胞作為靶細胞進行體外殺傷實驗驗證，結果表明效靶比越高，腫瘤殺傷率越高，Her-2慢病毒轉染組殺傷率明顯高于空載體轉染組和單純DC組(P<0.05)，而空載體組與對照組殺傷率并未發現有統計學區別(P=0.654)，再次證實Her-2修飾的DC疫苗的有效性和高效性。

綜上所述，構建特異性表達Her-2的慢病毒載體感染DCs后，可通過有效的遞呈腫瘤抗原來高效激活淋巴細胞，促進免疫應答，在體外試驗中表現出較強的殺瘤效果。這一結果為建立針對非小細胞性肺癌的特異性靶向免疫治療方案提供了一定的實驗依據。同時，基于免疫細胞在體內和體外環境中存在的功能差異和干擾因素問題，LV-Her2轉染DCs作為疫苗治療非小細胞性肺癌還有待于通過嚴格設計的臨床實驗來進行驗證。期望以后能通過進一步優化實驗設計條件，獲取更加完善的研究結果，為建立更有效治療肺癌的臨床方法提供更加有效、合理的依據。