克氏綜合征胎兒臍帶間充質(zhì)干細胞模型的建立

羅建安 楊樹法 于秀義 劉 欣 陳振文

(首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院醫(yī)學遺傳學與發(fā)育生物學學系，北京 100069)

克氏綜合征，即Klinefelter綜合征(Klinefelter’s syndrome, KS)，是最常見的性染色體三體綜合征。新生兒男嬰發(fā)病率為1/450至1/600[1]。KS患者的臨床表征為小睪丸、高促性腺激素性腺功能減退、乳房發(fā)育、學習困難。患者易患糖尿病、心血管、呼吸道和胃腸道疾病，常常導致較高的病死率[2-3]。患有KS的個體在嬰兒期、兒童期或成年期均患有醫(yī)療和社會功能障礙，對個人、家庭和社會產(chǎn)生有害影響。由于倫理的原因，對KS綜合征患者以及人體標本組織進行研究不易進行。目前缺乏足夠有效的實驗模型，因此KS綜合征的分子致病機制仍未被深入了解。過去的幾十年中，盡管通過誘導多能干細胞模型(induced pluripotent stem cells, iPSCs)一定程度上揭示了KS綜合征異常發(fā)育機制[4]，但由于iPSCs細胞模型的局限性，使有關KS的研究相對滯后，迫切需要建立一種更貼近疾病真實狀況的KS綜合征細胞模型。圍產(chǎn)期來源的臍帶結(jié)締組織，即沃頓組織(Wharton’s jelly, WJ)，具有快速增生、免疫調(diào)節(jié)能力強、 維持多系分化能力、基因組穩(wěn)定、無致瘤性和遺傳穩(wěn)定性好等特點。沃頓組織來源的間充質(zhì)干細胞(Klinefelter’s syndrome umbilical cord mesenchymal stem cells,KUMSCs)是多能細胞，可分化成骨細胞、軟骨細胞、脂肪和肌原細胞以及神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞[5-6]。由于Wharton細胞譜系的可塑性，使其成為發(fā)育生物學研究和再生醫(yī)學研究的重要材料[7]。本研究中，筆者從具有47，XXY染色體核型的KS胎兒臍帶中獲取并建立了間充質(zhì)干細胞系，鑒定了細胞模型的質(zhì)量和體外成骨成脂分化的潛能。本研究所建立的Klinefelter綜合征胎兒臍帶間充質(zhì)干細胞模型可成為研究圍產(chǎn)期KS胎兒異常發(fā)育的理想細胞模型，為深入研究KS疾病的致病機理和藥物研發(fā)提供了理想材料。

1 材料與方法

1.1 細胞的來源與培養(yǎng)

本研究經(jīng)過首都醫(yī)科大學醫(yī)學倫理委員會批準(批準號:2017-KY-043-01)，并獲得捐獻者的知情同意，從正常足月產(chǎn)及患有KS流產(chǎn)胎兒(采自首都醫(yī)科大學附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院)的臍帶中分離得到間充質(zhì)干細胞。

1.2 主要儀器和試劑

PCR儀(美國BIO-RAD公司)；PAC-30型電泳儀(美國BIO-RAD公司)；凝膠成像儀(美國BIO-RAD公司)；漩渦混合器(北京科爾德科貿(mào)有限公司)等。CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國ThermoFisher公司)；低溫離心機(Allegra X-15R)美國Beckman公司；支原體檢測試劑盒(美國R&D公司)；流式細胞儀(C6TM，美國BD公司)；胎牛血清(fetal bovine serum ,FBS)、胰酶(美國Gibco公司)；DPBS(美國Corning公司);秋水仙堿、Ⅱ型膠原酶(美國Sigma公司)；D-MEM/F12、間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基(友康生物公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)的原代分離、純化與擴增培養(yǎng)

將收集到的臍帶組織置于無菌玻璃皿中，用DPBS反復沖洗3～4次，去除血漬和其他雜質(zhì)，然后剪碎至1.0 mm3左右大小；加0.075%(質(zhì)量分數(shù))Ⅱ型膠原酶15 mL(具體視組織塊大小)，37 ℃水浴鍋中振蕩消化40 min，將消化好的組織混懸液置于無菌大玻璃皿中，清洗1～2次后，將消化過的臍帶小組織塊置于新的100 mL的有蓋小玻璃瓶中，加入0.125%(質(zhì)量分數(shù))的胰酶15 mL，37 ℃水浴鍋中振蕩消化40 min后將組織消化混懸液過濾(70 μm尼龍篩網(wǎng))，收集細胞懸液于50 mL離心管中，200 g低溫離心8 min。棄上清，向細胞沉淀中加入臍帶間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基(D-MEM/F-12∶FBS=10∶1)。取10 μL細胞混懸液和1.0 μL 0.4%(質(zhì)量分數(shù))的臺盼藍混合后進行細胞計數(shù)和細胞活率測定，具體傳代瓶數(shù)視計數(shù)結(jié)果而定，傳代至3～4代后凍存KUMSCs及二倍體臍帶間充質(zhì)干細胞(diploid umbilical cord mesenchymal stem cells，DUMSCs)細胞株(作為實驗對照)。

1.3.2 細胞安全性評價

預先獲取孕婦的病原體檢測信息，保證合格后進行干細胞制備；在原代、分離和傳代擴增培養(yǎng)后，獲取細胞培養(yǎng)上清液檢測細菌、真菌、支原體、病毒、梅毒螺旋體等病原體和內(nèi)毒素，檢測結(jié)果均為陰性，符合干細胞質(zhì)量要求。

1.3.3 成骨細胞誘導分化

使用P2～P3代的細胞，將細胞按(1.5～3.0)×103個/cm2的接種密度接種到6孔板中,按2.0 mL/孔的量加入臍帶間充質(zhì)干細胞專用培養(yǎng)基(D-MEM/F-12∶FBS=10∶1)，并標注對照孔和待誘導孔。細胞融合度達到85%以上時，根據(jù)六孔板標注加入對應的誘導分化液和間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基。

1.3.4 成脂細胞誘導分化

使用P2～P3代的細胞，將細胞按(1.5～3.0)×103個/cm2的接種密度接種到6孔板中,按2.0 mL/孔的量加入臍帶間充質(zhì)干細胞專用培養(yǎng)基(D-MEM/F-12∶FBS=10∶1)，并標注陰性對照孔和待誘導孔。待細胞融合度達到100%以上時，根據(jù)六孔板標注的加入對應的誘導分化液和間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基。

1.3.5 G顯帶染色體核型分析

將處于分裂中期的細胞與100 ng/mL秋水仙堿一起培養(yǎng)50 min。將細胞用0.25%(質(zhì)量分數(shù))胰蛋白酶/0.05%(質(zhì)量分數(shù))EDTA消化成單細胞，用低滲溶液KCl(0.075 mol/L)處理，用固定液固定2～3次。用預先配好的Giemsa工作液，充分染色10 min后用自然流水輕輕潤洗，觀察染色體的形態(tài)和數(shù)量，并用染色體核型分析軟件進行分析，保留圖譜。

1.3.6 流式細胞術分析細胞免疫表型

細胞用DPBS重懸到細胞濃度為5.0×106個/mL，并保證細胞總量在≥5×105/管。加入抗體前，將細胞懸液用DPBS洗滌2次，并棄去細胞上清，留取細胞沉淀。取EP管，將待檢細胞均分，并用DPBS洗滌2～3次，并在設置好對照管、檢測管和同型對照管后，加入對應流式熒光抗體試劑，4 ℃環(huán)境下避光孵育30 min，每10 min輕輕彈散一次。孵育結(jié)束后用流式細胞儀進行檢測和分析。

1.3.7 PCR擴增及產(chǎn)物電泳

為進一步證明建立的細胞模型具有多向分化潛能，利用RT-PCR及凝膠電泳方法測定成脂分化標志物過氧化物酶體增生劑激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPARγ)和成骨分化標記物骨橋蛋白(osteopontin， OSP)基因的表達。PCR擴增條件：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，26個循環(huán)，接72 ℃繼續(xù)延伸7 min。PCR產(chǎn)物于4 ℃保存。使用18S作為內(nèi)部對照。用于PCR的引物序列:(PPARγ：F3′-5′:CCAAGCTGCTCCAGAAAATG, R3′-5′:AGGAGCGGGTGAAGACTCAT; OSP：F3′-5′:CACCTGTGCCATACCAGTTAAAC, R3′-5′:ATCCATGTGGTCATGGCTTT″; 18S：F3′-5′:GTAACCCGTTGAACCCCATT, R3′-5′:CCATCCAATCGGTAGTAGCG)。稱取瓊脂糖2 g，加入到Tris-硼酸電泳緩沖液中，用微波爐加熱約5～10 min，自然冷卻至50 ℃左右，加入EB混勻，使EB終濃度為0.5 μg/mL，灌入插好梳子的凝膠槽中，約30 min后拔出梳子。將凝膠放入電泳槽中。吸取5 μL樣品加入凝膠孔中。在凝膠樣品中央或兩側(cè)加入5 μL的50 bp DNA Marker。電泳條件為120 V，35 min，將電泳后的瓊脂糖凝膠放入凝膠成像系統(tǒng)采集圖像并分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 建立細胞系均符合安全性評價標準

經(jīng)對分離培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細胞進行乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒、人巨細胞病毒、EB病毒、人嗜T細胞病毒和梅毒螺旋體的抗體和抗原以及細菌、真菌、支原體和內(nèi)毒素檢測，結(jié)果均為陰性，符合臍帶間充質(zhì)干細胞建系標準(表1)。

表1 病毒、螺旋體、細菌、真菌、支原體、內(nèi)毒素檢測Tab.1 Detection of viruses, bacteria, fungi, mycoplasma, endotoxin

2.2 KS胎兒臍帶間充質(zhì)干細胞中分離、形態(tài)學特征及核型分析鑒定

細胞經(jīng)傳代培養(yǎng)后長勢良好，臺盼藍染色后，細胞活率都在98%以上，鏡下觀察符合干細胞形態(tài)特征。為了檢測在臍帶間充質(zhì)干細胞傳代過程中細胞的染色體穩(wěn)定性，使用染色體核型分析技術檢測培養(yǎng)≥10代的DUMSCs及KUMSCs,結(jié)果顯示染色體核型分別為46,XY和47,XXY,說明該模型的遺傳穩(wěn)定性良好(圖1)。

圖1 KUMSCs和DUMSCs細胞模型構(gòu)建示意圖及核型分析Fig.1 Diagram for KUMSCs and DUMSCs cell model building and cytogenetic karyotyping

2.3 KUMSCs和DUMSCs細胞免疫表型具有間充質(zhì)干細胞的特征

為確定所分離的胎兒臍帶間充質(zhì)干細胞是否具有干細胞特性，流式細胞分析技術顯示臍帶間充質(zhì)干細胞的相關標志物CD105、CD90、CD73、CD44、 CD29呈陽性表達(均>98%)，抗原標志物CD34、CD45、HLA-DR表達陰性(均<2%)；DUMSCs和KUMSCs對間充質(zhì)相關標志物CD105、 CD90、 CD73、 CD44、 CD29呈陽性(且均>98%)；CD34、CD45、HLADR表達陰性(均<2%)，說明DUMSCs和KUMSCs均符合臍帶間充質(zhì)干細胞免疫學表征。詳見圖2。

圖2 DUMSCs和KUMSCs細胞免疫表型檢測Fig.2 Immunophenotyping analyses of KUMSCs和DUMSCs cell lines

2.4 KUMSCs和DUMSCs細胞具有成骨、成脂的分化潛能

表征MSCs的黃金標準是分化成多個譜系的能力。本結(jié)果顯示，PCR技術和瓊脂糖凝膠電泳鑒定成脂分化基因PPARγ在誘導分化前后表達量差異有統(tǒng)計學意義(圖3A)； PCR技術和瓊脂糖凝膠電泳鑒定成骨分化基因OSP在誘導分化前后表達量差異有統(tǒng)計學意義(圖3B)； 同時測定細胞的成骨分化潛能，在成骨分化培養(yǎng)基中誘導21 d后，通過茜素紅染色指示骨礦化的該沉積物呈陽性反應(圖3C)；另外測定細胞的成脂分化潛能，在成脂分化培養(yǎng)基中誘導21 d后，通過組織化學染色技術觀察到細胞中油紅O脂滴的大量積累(圖3D) 。

圖3 KUMSCs和DUMSCs成骨、成脂分化潛能Fig.3 Osteogenic and adipogenic differentiation potential of KUMSCs and DUMSCs cell lines

3 討論

Klinefelter綜合征是人類中常見的性染色體異常。幾乎所有的KS患者都表現(xiàn)出無精子癥，且易患糖尿病，心血管疾病和癌癥等疾病的風險增加，后代的染色體異常風險也會增加[8-9]，更好地了解KS發(fā)病基礎機制將有助于為患者提供新的治療方案。本研究從KS胎兒臍帶中成功分離并建立了間充質(zhì)干細胞KUMSCs細胞模型，這可用于KS的致病機制研究。以往研究[4, 10]KS綜合征常用的干細胞模型是胚胎干細胞(embryonic stem cells, ESCs)和人成體細胞誘導多能干細胞模型，例如源自成年人睪丸組織的iPSCs細胞模型。胚胎干細胞引起了倫理問題，而iPSCs是通過體細胞的直接重編程產(chǎn)生的，增加了iPSCs細胞的致瘤性和臨床安全性的問題[11-13]，尤其是c-myc 通過插入突變或破壞抑癌基因形成腫瘤[14]以及重編程引起的表觀遺傳記憶[15]。因此，在用于臨床應用的ESC或iPSCs的過程中，需要采取關于安全性和功效的預防措施。

在早期MSCs臨床前和臨床試驗中，移植的MSCs的安全性在動物模型和人體試驗中得到了充分證明[16-17]。本課題組所建立的KS胎兒臍帶間充質(zhì)干細胞模型經(jīng)流式細胞術和核型分析技術鑒定其沒有發(fā)生染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)的改變，具有遺傳穩(wěn)定性，但仍需進行進一步研究，以確保細胞模型的安全性。此外，對正常二倍體及KS胎兒來源的間充質(zhì)干細胞進行相關質(zhì)量控制檢測，包括病原微生物學(細菌、真菌、支原體、病毒、螺旋體)、內(nèi)毒素、細胞數(shù)、細胞活率等檢測，結(jié)果表明所建立的細胞系DUMSCs和KUMSCs具有安全性。

細胞的純度和狀態(tài)直接影響細胞的鑒別和誘導分化的效果。從Wharotn’s jielly中分離間充質(zhì)干細胞通常有兩種分離方式：外植體方法和酶消化方法[18]。外植體方法的缺點是片段通常漂浮在培養(yǎng)基中。與外植體方法相比，酶消化方法可以提供更均質(zhì)的細胞群和更一致的細胞數(shù)目。因此，本研究中先后使用酶消化法[0.075%(質(zhì)量分數(shù))的Ⅱ型膠原酶和0.125%(質(zhì)量分數(shù))的胰酶]進行實驗，成功獲得了理想的干細胞。本研究顯示KUMSCs具有干細胞的典型特征，但在細胞形態(tài)上與DUMSCs的形態(tài)卻有明顯區(qū)別，主要是旋渦狀生長趨勢、細胞短梭形、細胞立體感、光澤度、分裂象方面存在一定差異。

流式細胞技術檢測數(shù)據(jù)結(jié)果表明兩種細胞模型在CD105、CD73、CD90、CD44、CD29均大于98%，而CD34、CD45、HLA-DR均小于2%，均符合干細胞免疫表型的要求[19-20]。但免疫表型的檢測與細胞培養(yǎng)代數(shù)不同而表現(xiàn)出差異，為確保實驗的準確性，筆者均選取大于P3代細胞純度更高的細胞進行檢測分析。

總之，本研究所建立的KS胎兒臍帶間充質(zhì)干細胞系為高質(zhì)量多能干細胞，具有遺傳穩(wěn)定性和良好的分化潛能，可用于KS疾病的發(fā)病機制研究和藥物開發(fā)實驗。未來的研究，例如評估KUMSCs細胞模型的臨床藥物實驗的研究，將進一步表征這些細胞在潛在治療用途中的效用。