血漿凝溶膠蛋白與絕經后婦女的髖部骨密度相關性研究

苗二芽 李穎波 蔡少康 吳群 蔡毅

華中科技大學同濟醫學院附屬武漢中心醫院疼痛科，湖北 武漢 430014

骨質疏松癥(OP)是一種慢性骨病，是世界范圍內日益嚴重的公共衛生問題。其主要特征是骨密度低(BMD)和骨微結構破壞，導致骨質疏松性骨折(OF)的風險急劇增加，好發生于髖部和脊柱。髖部骨質疏松性骨折是最具有破壞性的后果之一，具有高死亡率和致殘率[1]。據報道，美國約有200萬男性和800萬女性患有OP，同時估計有3 400萬人患有骨量減少[2]。在歐洲，大約有550萬男性和2 200萬女性被診斷為OP[3]。在中國，患病率從2008年前的14.94%增加到2012～2015年的27.96%，這給家庭和社會帶來了巨大的經濟負擔[4]。最近的研究表明，凝溶膠蛋白(GSN)水平與許多疾病有關，如乳腺癌、口腔癌、多發性硬化和類風濕關節炎[5]。GSN還與破骨細胞的功能有關，例如，缺乏GSN表達的小鼠會導致骨吸收的減少和骨量和強度的增加[6]。一項臨床蛋白質組學研究表明，GSN對維持白人女性的BMD非常重要[7]。這些結果強調了GSN對BMD和骨代謝的重要影響。此外，GSN具有從骨髓組織中分泌的潛在能力。尚不清楚血漿GSN是否與BMD相關及是OP的潛在生物標志物。為了解決上述問題，我們研究了中國人群中血漿GSN是否與人體BMD和骨轉換標志物相關。

1 材料和方法

1.1 研究方案

本研究納入2017年7月到2018年6月這個時間段在我院就診的患者(>55歲)為研究對象。包括226名受試者(男性114名，年齡67.1±6.5歲；女性112名，年齡66.8±6.9歲)。所有女性都是絕經后的女性。通過問卷收集具體信息，例如年齡、身高、體重和病史等。對于全部受試者(A組)，按照是否患有骨質疏松癥分為骨質疏松癥組(OP組，BMDT評分≤-2.5)和BMD正常組 (NBMD組，BMDT評分≥-1)兩組；隨后將所有女性按照是否年齡超過70歲分為小于70歲組(B組)和大于70歲組(C組)兩組；為了盡量減少對骨量的潛在混淆影響，嚴格按照納入和排除標準進行選取受試者。排除包括涉及重要器官(如心臟、肺、肝、腎和腦)的慢性疾病、嚴重的代謝性疾病(如糖尿病、甲狀腺功能亢進或甲狀旁腺功能亢進)和其他骨骼疾病(如佩吉特)疾病和類風濕關節炎，長期使用影響骨代謝的藥物(如皮質類固醇治療和抗驚厥藥物)患者。該研究獲取醫院倫理委員會的批準。每位受試者均簽署知情同意書。

全髖BMD值(g/cm2)通過使用雙能X射線骨密度儀(DXA，美國Hologic公司)測量股骨頸、大轉子和轉子間的BMD值，所有DXA測量均由經過培訓的操作員執行。髖部骨密度的變異系數為2.49%。在早晨7:00～9:00抽取每個受試者靜脈血，并通過離心提取血漿并將其保持在-80 ℃冰箱中供以后使用。通過自動分析儀測量血漿葡萄糖、總膽固醇和三酰甘油的水平。通過酶聯免疫吸附測定(ELISA)測定血漿凝溶膠蛋白(GSN)水平。通過ELISA(FeikangBiotec, Guangzhou, China)測定兩種常用的生物標志物I型前膠原氨基端前肽(P1NP)和C-末端肽I型膠原的β異構化(β-CTX)并用于測量骨轉換率。

1.2 統計學處理

SPSS 19.0軟件用于所有統計數據的分析。所有數據均以均數±標準差表示。采用t檢驗，協方差分析，Pearson相關分析和偏相關來分析血漿GSN水平與其他代謝指標的關系。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

最終納入226位受試者，其中男性114例，女性112例；受試者的基本特征和代謝指標表示在表1中。正如預期的那樣，OP患者和NBMD受試者之間的全髖BMD在三組(A、B和C組)中顯著不同。骨轉換的標志物(P1NP、β-CTX和β-CTX/P1NP)在某些情況下表現出顯著差異。在其他三個代謝指標(血糖、總膽固醇、三酰甘油)中，只有血糖在某些情況下顯示出差異，例如在B組中。總膽固醇和三酰甘油在三個亞組中的任何一個中都沒有顯著差異。我們測試了NBMD受試者與OP受試者之間血漿GSN水平的差異。ELISA測定法測得樣品中血漿GSN蛋白水平范圍為89.65至463.73 ng/mL。考慮到年齡、BMI和P1NP對BMD的影響，我們采用協方差分析來調整混雜效應。在A組中男性和女性之間沒有觀察到血漿GSN水平的差異(P=0.977)。

我們發現血漿GSN水平在男性中差異無統計學意義(P=0.665)，但在女性中發現差異有統計學意義(P=0.009) (圖1)。與A組中的發現一致，B組中的差異也具有統計學意義(P=0.009)。在C組的中，與NBMD受試者相比，OP受試者的血漿GSN水平升高1.16倍(230.08±96.84對比199.16±60.93ng/mL)，差異具有統計學意義(P=0.037)。對A或B組中的所有女性，統計分析顯示差異更為顯著，在OP受試者和NBMD受試者中血漿GSN水平的差異更具有統計學意義(P=0.016)(圖1)。

圖1 OP和NBMD受試者之間血漿GSN水平的差異注：由于年齡，BMI和P1NP對BMD的顯著影響，我們采用協方差分析來調整三組的混雜效應，以比較OP和NBMD之間是否存在統計學差異。A：A組的總體；B：A組的男性；C： A組的女性；D：B組；E：C組；F： B組和C組的女性，*P<0.05。Fig.1 Difference in plasma GSN levels between patients with OP and NBMD

Pearson相關分析顯示B組和C組的血漿GSN與BMD之間的呈現負相關性(r=-0.19，P=0.018)。由于BMD與PINP(r=-0.35，P=0.002)、年齡(r=-0.38，P<0.001)和BMI(r=0.70，P<0.001)顯著相關，我們采用部分相關來消除P1NP、年齡和BMI對BMD的影響。GSN與BMD呈顯著的負相關(r=-0.26，P=0.033) (圖2)。GSN與骨轉換標志物和代謝指標的相關性分析顯示，在A組的女性患者中僅血糖與血漿GSN呈正相關，而血漿P1NP或β-CTX與血漿GSN無相關性。

表1 三組的基本特征Table 1 Basic characteristics of the three groups

注：與NBMD比較，*P<0.05。

圖2 血漿GSN濃度與全髖BMD的相關性注：調整了協變量BMI、年齡、P1NP對BMD的影響后，進行部分相關分析以分析來自B組和C組的合并受試者中血漿GSN與全髖BMD的關聯。Fig.2 Correlation between plasma GSN concentration and total hip BMD

3 討論

本研究探索了血漿GSN和中老年人群的BMD相關性。結果顯示，在NBMD與OP受試者中，血漿GSN水平顯著升高，并且與絕經后婦女的髖部BMD呈負相關。總的來說，本研究的結果表明血漿GSN與老年女性的髖部骨密度有關，據我們所知這也是國內首次關于這方面的研究。

凝溶膠蛋白(GSN)是凝溶膠蛋白超家族的基礎蛋白[8]，在哺乳動物和非哺乳動物的組織和器官中具有多種功能[9]。它可以切斷肌動蛋白絲，限制末端的快速生長和調節人體肌動蛋白絲在鈣離子和pH環境下的生長中起重要作用，這可以刺激GSN與肌動蛋白的結合[10]。最近的研究表明，GSN水平與許多疾病有關，如乳腺癌、口腔癌、多發性硬化和類風濕關節炎[5,11]。GSN在肌動蛋白細胞骨架組織中切斷和封閉肌動蛋白絲起著重要作用[8]。它對于樹突狀結構組裝，快速細胞運動和信號轉導至關重要[12]。樹突狀結構是細胞骨架結構，其中肌動蛋白發生快速聚合/解聚[13]，這對于破骨細胞、活化的內皮細胞、巨噬細胞和樹突細胞中的細胞黏附、機械感知和基質重塑非常重要[14-15]。

破骨細胞可以降解骨基質，包括細胞外基質和一些礦物質成分，這對骨重建和維持鈣平衡至關重要[16]。骨吸收過程的破骨細胞的活化依賴于肌動蛋白細胞骨架的完整性以及小體的黏附和運動功能[17]。以前的研究表明，GSN缺乏會導致無法產生Podosomes，即肌動蛋白細胞骨架結構異常、破骨細胞運動率降低、阻斷Podosome相關的信號轉導，并最終導致骨吸收減少，并增加骨量和強度[12]。血漿GSN水平在兩種性別之間沒有顯著差異。然而，特別是在女性的高BMD受試者和低BMD受試者之間觀察到血漿GSN水平的顯著差異。

研究結果表明，GSN的功能可能受到性別特異性因素的影響，例如性激素。先前的研究表明，GSN可作為調節雄激素介導的破骨細胞生成和骨吸收作用的調節因子[16]。GSN是否與雌激素相互作用以影響骨代謝和BMD尚不清楚，未來還有待研究。GSN具有兩種蛋白質同種型，即細胞內和細胞外同種型，其中血漿GSN與細胞質GSN不同[18]。 GSN可以表達并可能從CMC中分泌出來。正如兩項獨立的臨床蛋白質組學研究所證明的那樣，CMC中GSN的表達在不同種族女性的低BMD受試者和高BMD受試者中顯著不同。在此，發現血漿中的GSN較弱但與髖部BMD顯著相關。上述發現強化了GSN對骨代謝的重要性，但需要進行深入研究以確定血漿GSN對骨吸收和骨形成的影響。

總之，通過本研究的結果表明 OP患者血漿GSN水平顯著高于絕經后非骨質疏松女性。GSN可能是參與OP分子發病機制的潛在生物標志物。