生物信息學(xué)分析篩選肺腺癌關(guān)鍵基因及通路

余東虎，黃靜宇，沈小艷，汪育錦，李 勝，胡衛(wèi)東

肺癌是世界第一大癌癥，每年約造成150萬人死亡，而肺腺癌是最常見的肺癌類型，約占肺癌的40%[1]。肺腺癌早期多無征兆，一般生長較慢，通常診斷出來時(shí)已是晚期，治療上存在困難，因此，從基因?qū)用孢M(jìn)一步了解肺腺癌，能給臨床提供更多的解決方法。一些基因已經(jīng)被報(bào)道過與肺腺癌之間的聯(lián)系，Salim等[2]研究發(fā)現(xiàn)DKK1是潛在的非小細(xì)胞肺癌的治療靶點(diǎn)，Shi等[3]報(bào)道MAD2L1可能是肺腺癌的一個(gè)預(yù)后靶標(biāo)。但是，肺腺癌的發(fā)生機(jī)制仍然有待進(jìn)一步的研究。本研究利用生物信息學(xué)方法對(duì)基因芯片GSE10072進(jìn)行分析，以此獲得差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEGs)，同時(shí)還對(duì)DEGs進(jìn)行聚類分析和功能富集分析，并且構(gòu)建蛋白互作(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)來篩選核心基因，最后通過GEPIA數(shù)據(jù)庫對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，期待提供給肺腺癌更多的診斷靶標(biāo)。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取 在美國國立生物技術(shù)信息中心創(chuàng)建并維護(hù)的基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus,GEO；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中下載編號(hào)為GSE10072的基因芯片，該芯片的平臺(tái)信息：GPL96 [HG-U133A] Affymetrix Human Genome U133A Array，共有107個(gè)樣本，其中49例正常肺組織樣本，58例肺腺癌組織樣本。將58例肺腺癌組織樣本作為實(shí)驗(yàn)組，49例正常肺組織樣本作為對(duì)照組。

1.2 樣本的預(yù)處理、聚類分析 利用R軟件讀取文件后，使用RMA算法，將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后得到基因的表達(dá)矩陣，計(jì)算樣本間的Pearson相關(guān)矩陣中不同樣本之間的距離，對(duì)樣本進(jìn)行聚類分析。

1.3 DEGs的分析 用R軟件讀入預(yù)處理后得到的基因表達(dá)矩陣文件，用Limma包對(duì)58例肺腺癌組織樣本和49例正常肺組織樣本進(jìn)行基因差異表達(dá)分析[4]。DEGs篩選標(biāo)準(zhǔn)是錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate,FDR)<0.05和基因表達(dá)值倍數(shù)變化>2或<-2。

1.4 功能與富集分析 使用DAVID在線分析平臺(tái)(https://david.ncifcrf.gov/)[5]對(duì)DEGs在基因本體(Gene Ontology,GO)中注釋這些基因參與的生物學(xué)過程(biological process,BP)，并且利用京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)進(jìn)行通路分析，F(xiàn)DR<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5 PPI網(wǎng)絡(luò)與樞紐基因的篩選 采用STRING數(shù)據(jù)庫[6]分析肺腺癌組織和正常肺組織DEGs之間的PPI關(guān)系，構(gòu)造出PPI網(wǎng)絡(luò),閾值條件為綜合評(píng)分大于0.4。將分析的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件[7]后，利用網(wǎng)絡(luò)分析插件計(jì)算節(jié)點(diǎn)的連通度，以此篩選網(wǎng)絡(luò)中心節(jié)點(diǎn)，中心節(jié)點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因是核心基因。

1.6 核心基因的驗(yàn)證 用GEPIA(http://GEPIA.cancer-pku.cn/)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證與生存分析。GEPIA是一個(gè)基于TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫的網(wǎng)站工具，具有差異表達(dá)分析、輪廓繪圖和患者生存分析等功能[8]。使用GEPIA能避免下載TCGA原始數(shù)據(jù)再進(jìn)行生存分析的繁瑣，不足之處是無法查看基因與癌癥患者的臨床病理相關(guān)性，但結(jié)果仍然具有嚴(yán)格的統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié)果

2.1 樣本聚類情況 結(jié)果顯示58例肺腺癌組織樣本(實(shí)驗(yàn)組)和49例正常肺組織樣本(對(duì)照組)聚類良好，107例樣本均可用于下一步分析(圖1)，差異基因熱圖也顯示樣本聚類分界明確(圖2)。

圖1 樣本聚類情況

紅色表示高表達(dá)，綠色表示低表達(dá)圖2 差異基因熱圖

2.2 DEGs情況 設(shè)FDR<0.05和基因表達(dá)值倍數(shù)變化>2或<-2為篩選條件，肺腺癌組織和正常肺組織DEGs有888個(gè)，其中上調(diào)基因有317個(gè)，下調(diào)基因有571個(gè)(圖2)。

2.3 DEGs的生物學(xué)功能注釋 GO功能注釋表示，有11個(gè)富集高的肺腺癌DEGs富集的BP(表1)，其中相關(guān)程度高的BP是細(xì)胞粘附、藥物反應(yīng)以及細(xì)胞外基質(zhì)的組成。

表1 功能富集(GO)

2.4 DEGs的KEGG信號(hào)通路 肺腺癌DEGs富集到的KEGG通路中富集度程度高的有2條，分別是細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用通路、補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)通路(表2)。

表2 KEGG通路富集

2.5 通過Cytoscape軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò) 根據(jù)每個(gè)基因的節(jié)點(diǎn)數(shù)目排序，得到8個(gè)節(jié)點(diǎn)數(shù)最多的基因，即最相關(guān)的核心基因：GAPDH，IL6，TOP2A，CDK1，MMP9，BIRC5,EDN1,CCNB1(圖3)。

紅色的點(diǎn)表示高表達(dá)基因，藍(lán)色表示低表達(dá)基因圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 核心基因外部驗(yàn)證 通過查詢GEPIA腫瘤數(shù)據(jù)庫，相較正常組織，GAPDH，TOP2A,CDK1,MMP9,BIRC5,CCNB1在肺腺癌中高表達(dá)，IL6，EDN1在肺腺癌中低表達(dá)；在生存分析中，GEPIA基于TCGA數(shù)據(jù)庫，有514個(gè)腫瘤組織(但只有502名患者有較完整的臨床信息)和59個(gè)正常組織，肺腺癌患者的部分臨床信息如表3所示。顯示GAPDH,TOP2A,BIRC5,CCNB1的表達(dá)量與肺腺癌的預(yù)后相關(guān)，都具有嚴(yán)格的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但I(xiàn)L6,CDK1,MMP9,EDN1與預(yù)后的關(guān)系無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 肺腺癌患者的部分臨床信息

3 討論

通過對(duì)基因芯片GSE10072分析，共發(fā)現(xiàn)888個(gè)DEGs，其中上調(diào)基因有317個(gè)，下調(diào)基因有571個(gè)，GO功能富集和KEGG通路富集顯示在肺腺癌的發(fā)生進(jìn)展中細(xì)胞外基質(zhì)的變化起到重要作用。同時(shí)還對(duì)DEGs構(gòu)建了PPI網(wǎng)絡(luò)，然后篩選出了8個(gè)核心基因，分別是GAPDH，IL6，TOP2A，CDK1，MMP9，BIRC5,EDN1和CCNB1。

通過數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證顯示，上調(diào)的核心基因GAPDH調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的過程并參與細(xì)胞癌變進(jìn)程，它的表達(dá)狀態(tài)在癌細(xì)胞中會(huì)被解禁[9]。Nicholls等[10]發(fā)現(xiàn)GAPDH作用于端粒酶復(fù)合體，會(huì)讓癌細(xì)胞持續(xù)增殖。KRAS突變能促發(fā)癌癥。Brooks等[11]報(bào)道IL6能引發(fā)KRAS突變，在肺腺癌細(xì)胞中IL6表達(dá)增強(qiáng)，遺憾的是，我們得到正好相反的結(jié)果。TOP2A是另一個(gè)重要的上調(diào)核心基因，它不僅參與DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄與DNA重組，也參與了染色質(zhì)重塑的過程[12]，研究顯示TOP2A高表達(dá)在前列腺癌、腎上腺皮質(zhì)癌、乳腺癌和子宮平滑肌肉瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中起重要作用。但目前還沒有研究涉及肺腺癌受TOP2A表達(dá)水平的影響。CDK1基因是細(xì)胞G2-M期過渡的關(guān)鍵因素，這就是眾所周知的成熟促進(jìn)因子[13]。Jacquot等[14]發(fā)現(xiàn)四環(huán)三萜葫蘆素能有效抑制非小細(xì)胞肺癌，可檢測到CDK1表達(dá)明顯增強(qiáng)。MMP9編碼的蛋白可以降解組織中基底膜主要成分，能讓腫瘤細(xì)胞突破原發(fā)腫瘤部位[15]。Yu等[16]發(fā)現(xiàn)MMP9活性水平能作為切除Ⅰ期B型肺腺癌的預(yù)后評(píng)價(jià)的指標(biāo)。這些研究都與我們的結(jié)果相一致。BIRC5是另一個(gè)上調(diào)基因，研究表明，BIRC5可以通過調(diào)節(jié)Arf6表達(dá)發(fā)揮其作用[17]，故而猜測Arf6也是肺腺癌進(jìn)展的作用基因。Baykara等[18]發(fā)現(xiàn)位于17號(hào)染色體上的BIRC5基因在肺癌細(xì)胞中表達(dá)增強(qiáng)。下調(diào)基因EDN1缺乏與癌癥相關(guān)性，是值得研究的新方向。Shi等[19]發(fā)現(xiàn)ISL1是CCNB1基因表達(dá)的新型調(diào)節(jié)器，并且敲除ISL1之后，CCNB1的表達(dá)量會(huì)減少，故而可推測ISL1也是肺腺癌潛在的治療靶點(diǎn)。

本研究通過生物信息學(xué)方法篩選出了DEGs，發(fā)現(xiàn)了GAPDH，IL6，TOP2A，CDK1，MMP9，BIRC5,EDN1,CCNB1這8個(gè)核心基因，它們有可能成為肺腺癌的治療靶點(diǎn)和診斷靶標(biāo)，但仍需要相關(guān)的生物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討它們?cè)诜蜗侔┲械木唧w作用機(jī)制。