參地顆粒對慢性腎小球腎炎脾腎虧虛證患者細胞毒T 淋巴細胞相關抗原-4∕外周單個核細胞B7-1介導的免疫炎癥紊亂的影響

茅燕萍,王億平,陳成,張磊,魏玲,任克軍,金華,王東,章雪蓮

（安徽中醫藥大學第一附屬醫院腎病科，安徽合肥 230031）

慢性腎小球腎炎（chronic glomerulonephritis，CGN）簡稱慢性腎炎，為免疫介導的腎臟損傷，已成為我國導致終末期腎病的首要病因[1]。糖皮質激素及細胞毒類藥物等免疫抑制劑控制CGN蛋白尿的療效顯著，但其毒副作用較大，并存在全身免疫抑制而導致機會性感染的風險增加。中醫藥在調節免疫功能、減少免疫抑制劑所帶來的代謝紊亂和抵抗力下降等方面有獨特的作用。本課題組的前期研究結果認為，CGN的基本病機是脾腎虧虛、精微下注。參地顆粒由清朝新安醫學名家程林所著《圣濟總錄纂要·卷十三·虛勞門》中的人參湯化裁而成，功效為健脾益腎、固攝精微[2]。前期大量臨床研究[3-11]表明，參地顆?？梢悦黠@改善脾腎虧虛型CGN患者的臨床癥狀，降低證候積分，減少24 h尿蛋白定量及尿紅細胞量。隨著免疫學的快速發展，自身免疫性疾病的病變機制研究及治療有長足的進步，免疫反應參與CGN病程已經得到廣泛的證實和高度的重視。在參地顆粒的臨床研究中也發現其對于患者免疫功能的調節作用[3，4]，尤其是對于T細胞活化及外周單個核細胞B7-1（CD80）水平的異常表達；在參地顆粒對于系膜增生性腎小球腎炎大鼠干預研究中也展現出了一定的調節能力[12]。B7-1作為重要的共刺激分子在抗原提呈細胞（anti-gen presenting cells，APC）表面表達，其與T細胞表面CD28分子相互結合可介導T細胞的增殖與分化，從而引起細胞與體液免疫。B7-1分子的配體為 T細胞表面的CD28∕CTLA-4。其中CD28作為正性信號可促進T細胞活化，外周細胞毒T淋巴細胞相關抗原-4（CTLA-4）則是T細胞活化的下調因子[13]。大多數研究表明，觸發CTLA-4可以下調整個T細胞群的增殖以及抑制細胞因子的合成。此外，CTLA-4∕B7-1與Th細胞密切相關，B7-1能促進Th細胞分化，產生白細胞介素2（IL-2）、干擾素γ（IFN-γ），造成Th1∕Th2細胞紊亂，調節腎臟病的進展。因此，擬通過開展本研究以進一步明確參地顆粒對于CTLA-4∕B7-1介導的免疫炎癥紊亂的調節機制，也為其臨床應用提供必要的依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象及分組 本研究病例均為2015年1月至2017年1月安徽中醫藥大學第一附屬醫院腎病科收治的符合納入標準的脾腎虧虛型CGN患者，共60例。按就診的先后順序依隨機數字表隨機分為治療組和對照組，每組各30例。另從本院體檢中心選擇20例同期健康體檢者作為正常組。本研究符合醫學倫理要求并獲醫院倫理委員會審核通過。

1.2 診斷標準 CGN診斷標準參照《內科學》[14]診斷標準。慢性腎臟病分期標準參照2012年國際腎臟病組織“改善全球腎臟病預后”（Kidney Disease；Improving Global Outcomes，KDIGO）分期標準[15]。中醫辨證標準參照《中藥新藥臨床研究指導原則》[16]制定的脾腎虧虛證標準。

1.3 納入標準 ①符合上述西醫學CGN診斷標準、慢性腎臟病分期標準及中醫脾腎虧虛證辨證標準；②為慢性腎臟病Ⅰ、Ⅱ期患者（腎小球濾過率 ＞ 60 mL∕min）；③24 h尿蛋白定量（24hUPr）＜3 g者；④年齡為18～70歲；⑤自愿參加本研究并簽署知情同意書的患者。

1.4 排除標準 ①合并有心腦血管疾病或嚴重傳染病患者；②正在服用激素、細胞毒藥物者；③妊娠期或哺乳期婦女；④生活不能自理或患精神疾病，不能按規定服藥者。

1.5 治療方法

1.5.1 西醫常規處理 2組患者均給予西醫常規處理，包括：①低鹽低脂飲食；②改善腎臟微循環；③對于高血壓患者應控制血壓低于140∕90 mmHg，降壓藥物的選擇依次為鈣通道阻滯劑、β受體阻滯劑、中樞性降壓藥等。

1.5.2 治療組 在西醫常規處理的基礎上，給予參地顆粒治療。用法：參地顆粒（藥物組成：紅參、茯苓、雞內金、川芎、熟地黃、五味子、桑螵蛸；由安徽中醫藥大學第一附屬醫院中草藥加工中心生產，規格：10 g×3包，每包含生藥34 g；批準文號：皖藥制字BZ20080025；生產批號：20140418），每日3次，每次1袋。

1.5.3 對照組 給予纈沙坦膠囊治療。用法：纈沙坦膠囊（北京諾華制藥有限公司生產，規格：80 mg×7粒；批準文號：國藥準字H20040217），口服，每日1次，每次80 mg。

1.5.4 療程 2組療程均為12周。

1.6 觀察指標及療效評價

1.6.1 臨床療效評價 參照《中藥新藥臨床研究指導原則》[16]制定。其中癥狀量化評分，按照癥狀的無、輕、中、重分別計0、2、4、6分。臨床疾病療效分臨床控制、顯效、有效和無效4級；中醫證候療效分臨床痊愈、顯效、有效和無效4級。

1.6.2 24 h尿蛋白定量（24hUPr） 采用常規生化法檢測24hUPr，尿液標本分別于治療前和治療后每隔4周收集1次，共4次。

1.6.3 血清IL-2、IL-6、IFN-γ、B7-1水平及尿B7-1水平檢測 運用酶聯免疫法（ELISA）檢測患者血清IL-2、IL-6、IFN-γ、B7-1水平及尿B7-1水平。所有實驗嚴格按照操作說明書進行。試劑盒均由上海源葉生物技術有限公司提供，生產批號分別為20161102A、20161122A、20161220A、20160122A、20160122A。

1.7 統計方法 采用SPSS 22.0軟件進行數據的統計分析。計量資料采用均數±標準差（）表示，計數資料采用率或構成比表示。若資料符合正態分布且方差齊，兩組間比較采用t檢驗，若資料不符合正態分布或方差不齊則采用非參數檢驗，多組間均數比較采用方差分析；單向有序定性資料采用秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2組患者脫落剔除情況 治療組有2例患者因在治療期間加用潑尼松，與本次試驗病例選擇標準不符而剔除；對照組有1例在治療期間加服雷公藤多甙片，2例未按規定服用纈沙坦而剔除，共剔除3例。最終實際完成試驗的治療組為28例，對照組為27例。

2.2 2組患者及正常組的基線資料比較 治療組28例患者中，男16例，女12例；平均年齡（38.12±12.58）歲；平均病程為（3.55±1.32）個月；就診時血壓高于140∕90 mmHg者15例。對照組27例患者中，男13例，女14例；平均年齡（39.34±12.03）歲；平均病程為（3.26±1.38）個月；就診時血壓高于140∕90 mmHg者13例。2組患者的性別、年齡、病程及血壓情況等基線資料比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。正常組20例健康體檢者中，男10例，女10例；平均年齡（42.45±10.18）歲。3組受試者的性別、年齡等基線資料比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），也具有可比性。

2.3 2組患者治療前后中醫證候積分比較 表1結果顯示：治療前，2組患者的中醫證候積分比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。治療后，2組患者的中醫證候積分均較治療前下降（P＜0.05），且治療組的降低作用明顯優于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表1 2組患者治療前后中醫證候積分比較Table 1 Comparison of TCM symptom scores in the two groups before and after treatment （，s∕分）

表1 2組患者治療前后中醫證候積分比較Table 1 Comparison of TCM symptom scores in the two groups before and after treatment （，s∕分）

①P＜0.05，與治療前比較；②P＜0.05，與對照組治療后比較

治療后30.59±3.39①19.68± 2.33①②組別對照組治療組N 28 27治療前40.37±4.15 40.50±3.28

2.4 2組患者中醫證候療效及臨床疾病療效比較 表2～表3結果顯示：治療組和對照組的中醫證候療效總有效率分別為92.86%、55.56%，臨床疾病療效總有效率分別為89.29%、62.96%；組間比較，治療組的中醫證候療效和臨床疾病療效均優于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。

2.5 2組患者治療前后24hUPr含量比較 表4結果顯示：治療前，2組患者的24hUPr含量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。治療后各個時點，對照組的24hUPr含量與治療前比較均無統計學差異（P＞0.05）；治療組在治療8周、12周后的24hUPr含量均較治療前明顯降低（P＜0.05），且其降低作用明顯優于對照組，差異有統計學意義（P ＜ 0.05）。

表2 2組患者中醫證候療效比較Table 2 Comparison of effect on TCM symptoms in the two groups n（p∕%）

表3 2組患者臨床疾病療效比較Table 3 Comparison of clinical efficacy on CGN in the two groups n（p∕%）

表4 2組患者治療前后24hUPr含量比較Table 4 Comparison of 24hUPr in the two groups before and after treatment （，m∕g）

表4 2組患者治療前后24hUPr含量比較Table 4 Comparison of 24hUPr in the two groups before and after treatment （，m∕g）

治療12周后0.99±0.12 0.54± 0.12①②組別對照組治療組N 27 28治療前1.76±0.56 1.76±0.66治療4周后1.64±0.45 1.63±0.52治療8周后1.29±0.75 0.98± 0.79①②

2.6 2組患者治療前后血清IL-2、IL-6、IFN-γ水平比較 表5結果顯示：治療前，2組患者血清IL-2、IL-6、IFN-γ水平比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），2組患者血清IL-2水平均較正常組下降，血清IL-6、IFN-γ水平均較正常組升高（P＜0.05）。治療后，2組患者血清IL-2水平均較治療前升高（P＜0.05），血清IL-6、IFN-γ水平均較治療前下降（P＜0.05）；組間比較，2組患者對血清IL-2表達水平的升高作用無統計學差異（P＞0.05）；而對血清IL-6、IFN-γ表達水平的降低作用治療組優于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。

2.7 2組患者治療前后血清和尿液B7-1表達水平比較 表6結果顯示：治療前，2組患者血清和尿B7-1表達水平比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），均較正常組水平明顯升高（P＜0.05）。治療后，2組患者血清和尿B7-1表達水平均較治療前下降（P＜0.05），但治療后2組患者的表達水平比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

表5 2組患者治療前后血清IL-2、IL-6、IFN-γ水平比較Table 5 Comparison of serum IL-2，IL-6，and IFN-γ levels in the two groups before and after treatment（）

表5 2組患者治療前后血清IL-2、IL-6、IFN-γ水平比較Table 5 Comparison of serum IL-2，IL-6，and IFN-γ levels in the two groups before and after treatment（）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與治療前比較；③P＜0.05，與對照組治療后比較

組別正常組對照組治療組治療后—19.81±2.13②13.87± 2.54②③N 20 27 28 IL-2[ρ∕（ng·mL-1）]治療前5.88±0.62 2.32±0.22①2.16±0.21①治療后—3.23±0.10②4.66±0.31②IL-6[ρ∕（pg·mL-1）]治療前101.85±40.25 196.32±36.89①200.54±37.98①治療后—162.41±39.56②122.65± 36.29②③IFN-γ[ρ∕（pg·mL-1）]治療前12.54±1.85 24.56±3.51①25.89±2.98①

表6 2組患者治療前后血清和尿液B7-1表達水平比較Table 6 Comparison of serum and urine B7-1 levels in the two groups before and after treatment （）

表6 2組患者治療前后血清和尿液B7-1表達水平比較Table 6 Comparison of serum and urine B7-1 levels in the two groups before and after treatment （）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與治療前比較

組別N正常組對照組治療組治療后—15.38±5.41②14.11±5.03②20 27 28血清B7-1[ρ∕（ng·mL-1）]治療前4.34±0.35 20.41±7.35①21.13±6.96①治療后—14.26±5.28②13.19±6.42②尿液B7-1[ρ∕（ng·L-1）]治療前12.88±3.21 18.66±4.55①18.72±4.36①

3 討論

CGN在歷代中醫古籍中歸屬于“慢腎風”、“尿濁”、“水腫”、“腰痛”、“虛勞”等疾病范疇。CGN的病因病機雖然各醫家觀點有所不同，但主要歸于脾腎虧虛。王億平教授認為其病機屬脾腎虧虛，先后天相互為用，一損俱損；如遇外邪侵襲，則癥狀加重；同時，患者大多有瘀血阻絡的表現，故臨床以健脾益腎為治療大法，并以活血化瘀法貫穿治療始終[17]。參地顆粒的基礎方人參湯首載于《圣濟總錄纂要》一書中，功效為健脾益腎、固攝精微?；谌藚珓撝频膮⒌仡w粒除上述功效外，尚具有活血化瘀之力。方中紅參補脾益肺、益腎助陽、固攝精微為君；茯苓、熟地黃健脾益腎，五味子養陰固精，桑螵蛸固精縮尿，雞內金攝精止遺，共為臣藥；川芎活血化瘀，為佐使之用，全方合用，共奏健脾益腎、固攝精微之功，又兼活血化瘀之效。

CGN的發病機理一直是臨床及科研工作者研究的熱點，病程中由于免疫反應的異常出現腎臟病理損傷得到廣大腎臟病學者的認同，即體液免疫與細胞免疫在腎臟病中交相作用。本研究通過檢測血清IL-2、IL-6、IFN-γ水平發現，CGN患者確實存在細胞因子紊亂。由Th細胞分泌的IL-2在機體免疫應答過程中起關鍵作用。本研究中患者血清IL-2水平明顯降低，通過治療后有所升高，說明參地顆粒可以通過刺激IL-2分泌保護腎臟，與既往研究結果相似[18]。IL-6是加速腎小球疾病的重要因子，發生系膜增生性腎小球腎炎時，在沉積的免疫復合物刺激作用下可分泌IL-6，其作為病理性細胞因子又可反過來刺激系膜增生、系膜基質增多，加速腎臟病理惡化，因此，IL-6是與腎臟病變聯系最為緊密的細胞因子之一[19]。IFN-γ屬于典型的Th1細胞因子，其來源廣泛，CD4＋T細胞、自然殺傷（NK）細胞均可分泌，主要參與細胞免疫。發生自身免疫性疾病時可刺激CD4＋T細胞表達IL-2、IL-12等因子，導致Th1∕Th2細胞比例失衡。目前已經證實IFN-γ與系統性紅斑狼瘡、IgA腎病等有關[20]。本研究結果表明，經過治療后患者血清IFN-γ水平明顯下降，與既往研究結果相似。因此，IFN-γ可通過刺激系膜細胞增生對腎臟血流動力學產生影響，使血漿蛋白等大分子物質通透性增加，從而加速腎臟病理變化。由此可見，CGN患者普遍存在Th1∕Th2細胞因子的失衡，IL-2、IFN-γ、IL-6不僅是免疫應答時產生的免疫介質，又可加速腎臟病理進程。

自身免疫性疾病的發生主要是由于機體內抗原抗體反應產生的免疫復合物沉積造成的炎癥性反應，其中免疫細胞的異?；罨且鸢l病的基礎。在活化的T細胞表面可見細胞毒T淋巴細胞相關抗原-4（CTLA-4）的表達，與CD28競爭性結合B7（B7-1、B7-2）產生不同的生物學效應。CD28與B7結合后可促進T細胞活化，CTLA-4（CD152）與B7結合后發揮抑制性作用，機體內正常的功能活動是先由CD28提供共刺激信號促進T細胞活化，然后CTLA-4激活并競爭性結合B7分子下調免疫反應，抑制T細胞的過度激活[21]。實驗研究表明[22]，敲除實驗大鼠CTLA-4基因后會出現自身免疫疾病，因此推測CTLA-4∕B7在機體免疫調節方面占有重要的作用，如出現平衡紊亂則易引起疾病的發生。B7-1（CD80）表達于B細胞表面，是CD28∕CTLA-4的共同受體，可在腎臟足突細胞上表達[23]，但正常腎臟上無表達，持續炎癥、缺氧的狀態體內B7-1會上調，這與本研究結果一致，即治療組和對照組患者血清及尿液B7-1的表達均較正常組明顯增多，但經治療后均下調。其引起蛋白尿的機制可能是影響腎小球濾過屏障，而敲除大鼠B7-1基因后則未發生蛋白尿。此外，CTLA-4∕B7與Th細胞密切相關，Th前體細胞（Th0）分化為Th1細胞這一過程需要B7-1的參與，從而促進IL-2、IFN-γ等表達，因此共刺激分子可通過干擾Th1∕Th2因子紊亂，調節腎臟病的進展。本研究結果表明，參地顆粒對于脾腎虧虛型CGN患者的中醫證候積分、臨床癥狀及24hUPr水平均有一定的改善作用，這可能是參地顆粒通過調節CTLA-4∕B7-1信號系統，抑制炎癥因子的異常分泌，減輕免疫復合物的沉積而發揮作用，具體的作用機制有待進一步深入研究。