人胃癌細(xì)胞系SGC-7901干細(xì)胞樣細(xì)胞的富集與鑒定

林靜瑜,黃可兒,秦書敏,來慧麗

（1.福建省中醫(yī)藥研究院，福建福州 350003；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 廣東廣州 510405；3.廣東省中醫(yī)院大學(xué)城分院，廣東廣州 510006；4.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣東廣州 510520）

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率、死亡率分別位于全球惡性腫瘤的第5位和第3位。我國是胃癌的高發(fā)國家，2012年全球胃癌新發(fā)病例數(shù)及死亡例數(shù)約50%在中國，且農(nóng)村胃癌發(fā)病率是城市的2～4倍[1，2]。對于進(jìn)展期胃癌患者，單一的手術(shù)、放化療、免疫治療等都很難取得理想的療效[3]。

20世紀(jì)90年代腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells，CSCs）假說的提出，為腫瘤的起源、演進(jìn)以及化療耐藥等提供了新的理論基礎(chǔ)[4，5]，靶向腫瘤干細(xì)胞有望成為腫瘤防治的新途徑。雖然在白血病和一些實(shí)體瘤中已成功分離和鑒定出腫瘤干細(xì)胞[6-9]，然而直到2009年Takaishi S等[10]從6株人胃癌細(xì)胞系細(xì)胞株發(fā)現(xiàn)CD44可能是胃癌干細(xì)胞潛在的特異性標(biāo)志物時(shí)，對胃癌干細(xì)胞的研究才真正興起。但是，分離純化方法仍是胃癌干細(xì)胞研究的一大技術(shù)瓶頸。本研究采用成球條件培養(yǎng)法和流式側(cè)群分選法從人胃癌細(xì)胞系SGC-7901細(xì)胞中富集∕分離干性腫瘤細(xì)胞，并從克隆形成能力、成瘤能力以及化療耐藥性鑒定其干細(xì)胞樣的生物特性，為進(jìn)一步研發(fā)藥物對胃癌干細(xì)胞的靶向作用提供基礎(chǔ)?，F(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 人胃癌細(xì)胞株SGC-7901，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞所。

1.2 動(dòng)物 SPF級(jí)雌性4～6周齡BALB∕c（nu）裸小鼠，體質(zhì)量14～16 g，廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SYXY（粵）2013-0092。

1.3 主要試劑與儀器 RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM∕F12培養(yǎng)基、2.5 g∕L胰酶、磷酸鹽緩沖液（PBS）、表皮生長因子（EGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）、B27、N-2（美國Gibco公司）；胎牛血清（FBS，杭州四季青公司）；無血清條件培養(yǎng)基（DMEM ∕F12，含bFGF 10 ng∕mL、EGF 20 ng∕mL、B27 1%和N-2 1%，臨用時(shí)配制，4℃保存2周）；Cell-counting kit 8（CCK8，日本同仁化學(xué)所）；5-氟尿嘧啶注射液（5-FU）注射液（0.25 g∕支，上海旭東海普藥業(yè)有限公司，批號(hào)：FA141215）；注射用鹽酸多柔比星（ADM，10 mg∕瓶，深圳萬樂藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1407E1）；注射用順鉑（DDP，10 mg∕支，齊魯制藥有限公司，批號(hào)：407025CF）；Hoechst33342、維拉帕米（美國Sigma公司）。細(xì)胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板、超低吸附10 cm培養(yǎng)皿、超低吸附6孔板、超低吸附96孔板（美國Corning公司）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；相差顯微鏡（德國Leica公司）；多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）；低溫高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；FACSAria流式細(xì)胞儀（美國BD公司）。

1.4 成球條件培養(yǎng)法培養(yǎng)SGC-7901細(xì)胞 SGC-7901細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，37℃、5%飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中。取對數(shù)生長期的SGC-7901細(xì)胞，胰酶消化，離心；無血清條件培養(yǎng)基重懸，轉(zhuǎn)移至預(yù)先加入無血清條件培養(yǎng)基的10 cm超低吸附培養(yǎng)皿中或超低吸附6孔板中，隔日添加適量無血清條件培養(yǎng)基；待7～10 d細(xì)胞形成體積較大、結(jié)構(gòu)較緊密的懸浮聚集體（第一代細(xì)胞球），吸取細(xì)胞球，反復(fù)輕吹打使其成為單細(xì)胞，轉(zhuǎn)入離心管，800 r∕min，離心5 min，棄上清，無血清條件培養(yǎng)基重懸；按一定比例接種到超低吸附培養(yǎng)皿或超低吸附6孔板中，取第3代SGC-7901細(xì)胞球進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 流式細(xì)胞儀分選側(cè)群（SP）細(xì)胞 取對數(shù)生長期的SGC-7901細(xì)胞，胰酶消化，收集細(xì)胞，常溫1 000 r∕min，離心5 min，以含體積分?jǐn)?shù)10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106個(gè)∕mL。取離心管5只，分別加入10 mL細(xì)胞懸液，設(shè)置為陰性對照組與4個(gè)實(shí)驗(yàn)組。陰性對照組加入終濃度為30 μg∕mL的維拉帕米與2.5 μg∕mL的Hoechst33342，實(shí)驗(yàn)組分別加入終濃度為 4.0、3.5、3.0、2.5 μg∕mL 的 Hoechst33342，避光條件下于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中孵育90 min，每10～15 min取出混勻1次，孵育結(jié)束取出，避光，于1 200 r∕min，4℃，離心5 min，并用預(yù)冷的PBS洗滌2次；過40 μm的細(xì)胞篩網(wǎng)，上流式細(xì)胞儀檢測。350 nm紫外激發(fā)Hoechst33342，450∕20 nm帶通下收集測藍(lán)光，675 nm帶通下收集測紅光，Hoechst33342陰性或弱陽性為SP細(xì)胞，Hoechst33342陽性為非SP（non-SP）細(xì)胞，同時(shí)收集分離出的SP細(xì)胞與non-SP細(xì)胞。

1.6 克隆形成實(shí)驗(yàn) 分別吸取“1.4”項(xiàng)SGC-7901細(xì)胞球、正常SGC-7901貼壁細(xì)胞，以及“1.5”項(xiàng)收集的SP細(xì)胞和non-SP細(xì)胞，均以含體積分?jǐn)?shù)10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸，計(jì)數(shù)后以200個(gè)∕孔加入普通6孔板，每孔添加2 mL含體積分?jǐn)?shù)10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，各設(shè)3復(fù)孔，每3 d換液。2周后，棄培養(yǎng)基，加PBS潤洗2次，加2 mL多聚甲醛固定15 min，棄甲醛，加吉姆薩染液適量染色30 min，流水輕沖去染液，空氣干燥，拍照，計(jì)數(shù)大于100個(gè)細(xì)胞（直徑大于0.5 mm）的克隆，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn) 將BALB∕c（nu）裸小鼠分2批進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。第1批：SGC-7901細(xì)胞球組和SGC-7901細(xì)胞組；第2批：SP細(xì)胞組和non-SP細(xì)胞組。每組又按接種細(xì)胞數(shù)分3個(gè)小組，即5×105個(gè)∕mL、1 × 105個(gè)∕mL、1 × 104個(gè)∕mL組，每個(gè)小組隨機(jī)分配5只裸小鼠。取SGC-7901細(xì)胞球、SGC-7901細(xì)胞，當(dāng)日流式分選收集的SP細(xì)胞和non-SP細(xì)胞，分別配制為2.5 × 106個(gè)∕mL、5 × 105個(gè)∕mL、5×104個(gè)∕mL 3個(gè)密度的單細(xì)胞懸液，按分組于小鼠左腋窩皮下注射0.2 mL各細(xì)胞懸液。觀察裸小鼠一般狀態(tài)及局部成瘤生長情況，8周后處死，剝瘤，稱質(zhì)量。

1.8 化療耐藥實(shí)驗(yàn) 取SGC-7901細(xì)胞球及正常對數(shù)生長期的SGC-7901貼壁細(xì)胞，消化，分別用無血清條件培養(yǎng)基和體積分?jǐn)?shù)10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸，制備密度為5×104個(gè)∕mL的單細(xì)胞懸液，分別接種于超低吸附96孔板及普通96孔板，每孔5 000個(gè)、100 μL，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，18 h后分別加入同體積PBS及各梯度濃度的5-FU、ADM、DDP進(jìn)行干預(yù)，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，以加PBS組作為對照組，相應(yīng)空白培養(yǎng)基組為空白組。干預(yù)48 h后，取出，每孔加入10 mL CCK8，繼續(xù)培養(yǎng)2.5 h，取出，于酶標(biāo)儀450 nm處檢測吸光度[D（λ）]，計(jì)算細(xì)胞生長抑制率（p）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。1.9 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SGC-7901細(xì)胞球的富集∕分離情況 人胃癌細(xì)胞系SGC-7901在含生長因子的無血清條件培養(yǎng)基和超低吸附培養(yǎng)皿（板）中3～5 d即能形成數(shù)十個(gè)細(xì)胞組成的聚集團(tuán)，7～10 d能形成100個(gè)細(xì)胞以上結(jié)構(gòu)較緊密的細(xì)胞球。經(jīng)傳代，成球能力較上一代增加，表現(xiàn)為球體增大，成球時(shí)間更快，結(jié)構(gòu)更緊密。見圖1。

2.2 SGC-7901 SP細(xì)胞的分選情況 Hoechst33342的濃度為2.5、3.0、3.5、4.0 μg∕mL時(shí)SGC-7901細(xì)胞中SP細(xì)胞的檢出率分別為4.74%、2.67%、1.24%、0.47%，維拉帕米對照組檢出率為0.19%，見圖2。以2.5 μg∕mL作為后續(xù)收集SP和non-SP細(xì)胞的Hoechst33342濃度。

2.3 克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果 SGC-7901細(xì)胞球形成的克隆數(shù)明顯高于SGC-7901細(xì)胞（P＜0.01）；SGC-7901細(xì)胞SP與non-SP細(xì)胞克隆數(shù)差異無顯著性（P＞ 0.05），見圖3。

圖1 SGC-7901細(xì)胞及無血清條件培養(yǎng)的SGC-7901細(xì)胞球Figure 1 SGC-7901 cells and SGC-7901 cell spheres growing from serum-free cultivation

圖2SGC-7901細(xì)胞SP檢出率Figure 2 The rate of SP selection from SGC-7901 cells

2.4 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果 成瘤能力是鑒定腫瘤干細(xì)胞干性特性的金標(biāo)準(zhǔn)。接種1×105個(gè)細(xì)胞，SGC-7901細(xì)胞球組2周內(nèi)成瘤3只，成瘤率為60%，而SGC-7901細(xì)胞組8周內(nèi)均未能成瘤；接種5×105個(gè)細(xì)胞，SGC-7901細(xì)胞球組2周內(nèi)全部成瘤，SGC-7901細(xì)胞組成瘤2只，SGC-7901細(xì)胞球成瘤能力高于SGC-7901細(xì)胞；接種5×105個(gè)細(xì)胞，SP細(xì)胞組與non-SP細(xì)胞組8周內(nèi)分別成瘤3只、2只，其他2個(gè)細(xì)胞數(shù)量級(jí)上均未能成瘤，兩者成瘤能力差異不明顯。見表1。

圖3 克隆形成能力比較（n=3）Figure 3 Colony formation activity

表1 各組裸鼠成瘤情況比較Table 1 Comparison of tumor formation in nude rats [n例數(shù)（p成瘤率∕%）]

2.5 化療耐藥實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在相同濃度條件下，5-FU、ADM與DDP對SGC-7901細(xì)胞球的增殖抑制率呈低于SGC-7901細(xì)胞的趨勢，見圖4。

3 討論

腫瘤干細(xì)胞是一類存在于腫瘤內(nèi)部，具有自我更新能力和形成異質(zhì)性腫瘤的細(xì)胞，這種細(xì)胞能夠進(jìn)一步“分化”形成其他腫瘤細(xì)胞，被認(rèn)為在腫瘤的起動(dòng)、擴(kuò)散、維持、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)、化療耐藥中起著重要作用。一般認(rèn)為，胃癌干細(xì)胞起源于正常胃干細(xì)胞或產(chǎn)生突變的擁有自我更新能力的祖細(xì)胞和分化細(xì)胞，然而目前為止，胃癌干細(xì)胞的分離純化仍是一大難題，從現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道看，胃癌干細(xì)胞主要采用3類分離方法，包括特異性標(biāo)志物分選法、條件培養(yǎng)分選法和側(cè)群細(xì)胞分選法。特異性標(biāo)志物分選法是針對已經(jīng)明確干細(xì)胞特異性表面標(biāo)志物的細(xì)胞，通過流式或免疫磁珠分離，優(yōu)點(diǎn)是分離效率高、細(xì)胞活力好、分離純度高，但胃癌干細(xì)胞的表面標(biāo)志物如CD44、CD133、上皮細(xì)胞黏附分子等，亦常見于其他干細(xì)胞或祖細(xì)胞。側(cè)群細(xì)胞分選則是利用腫瘤干細(xì)胞具有外排核酸結(jié)合染料Hoechst33342的生物學(xué)特性，通過流式細(xì)胞儀加以分離。國內(nèi)外一些實(shí)驗(yàn)室也陸續(xù)報(bào)道在胃癌細(xì)胞系和原代胃癌細(xì)胞中分選到側(cè)群細(xì)胞，但對其是否具有干細(xì)胞特性存在著爭議[11-13]。腫瘤干細(xì)胞干性生物學(xué)特性的穩(wěn)定與獨(dú)特的生長“微環(huán)境”密切相關(guān)。條件培養(yǎng)分選法是基于在含有干細(xì)胞賴以生長的條件培養(yǎng)基中，利用腫瘤干細(xì)胞能夠懸浮聚集成球并維持其自我更新、多向分化和高致瘤性的特點(diǎn)，進(jìn)行干細(xì)胞的富集∕分離[14-16]。

圖4 SGC-7901細(xì)胞球、SGC-7901細(xì)胞對5-FU、ADM、DDP的耐藥性比較（n=3）Figure 4 Comparison of drug resistance of SGC-7901 cell spheres and SGC-7901 cells against 5-fluorouracil，doxorubicin hydrochloride and cisplatin

本研究在側(cè)群分選實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Hoechst33342濃度為2.5 μg∕mL時(shí)，SGC-7901細(xì)胞SP細(xì)胞分選率最高，約為5%左右，但SP細(xì)胞的克隆形成和裸鼠成瘤能力與non-SP細(xì)胞并無明顯差異。猜測可能有2個(gè)方面的原因：一是Hoechst33342本身具有一定的細(xì)胞毒性作用，導(dǎo)致SP細(xì)胞部分喪失腫瘤干細(xì)胞的特性；二是SGC-7901細(xì)胞雖然存在SP細(xì)胞，但SP細(xì)胞不具備腫瘤干細(xì)胞特性。

在成球條件培養(yǎng)分選實(shí)驗(yàn)中，為防止細(xì)胞的貼壁分化，我們將SGC-7901細(xì)胞全程培養(yǎng)于超低吸附培養(yǎng)板（培養(yǎng)皿）及含生長因子的無血清條件培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)SGC-7901細(xì)胞成球生長較在普通培養(yǎng)板好，且能夠連續(xù)傳5代以上，其克隆形成能力、化療耐藥性、致瘤性均明顯高于正常貼壁生長的SGC-7901細(xì)胞，說明該條件下培養(yǎng)的人胃癌細(xì)胞系SGC7-7901細(xì)胞球具有腫瘤干細(xì)胞樣生物學(xué)特性，同時(shí)也證明了胃癌細(xì)胞中存在著干細(xì)胞。

另外，本研究中SGC-7901細(xì)胞球與正常SGC-7901細(xì)胞在裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)中，移植的細(xì)胞數(shù)量級(jí)未能進(jìn)一步拉開差距，提示SGC-7901細(xì)胞球中干細(xì)胞的純度還有待進(jìn)一步提高。今后，我們考慮在優(yōu)化成球培養(yǎng)條件的基礎(chǔ)上，結(jié)合干細(xì)胞相關(guān)表型、上皮—間質(zhì)化等相關(guān)特性對胃癌組織及體外胃癌細(xì)胞系進(jìn)行干細(xì)胞的分離鑒定，為靶向胃癌干細(xì)胞的防治策略研究提供一定的參考信息。