四氫黃連堿體外抗炎作用及機理研究

黃慧敏，王紅梅，張斌強，陳琴華

（湖北省湖北醫藥學院附屬東風醫院，湖北十堰 442008）

炎癥的過度反應會對機體造成嚴重損害。傳統的抗炎藥物主要是甾體抗炎藥和非甾體抗炎藥，臨床療效顯著，但是副作用頻見報道[1，2]。因此，尋找高效低毒的新型抗炎藥是目前藥物研究的重要方向。近年來，天然藥物的抗炎作用得到了越來越廣泛的認可。四氫黃連堿（THC）是傳統中藥夏天無、延胡索、塞北紫堇的重要成分。目前，對THC的研究多集中于提取、分離及鑒定[3]，對其生物活性尤其是抗炎活性的研究較少。本課題組前期研究結果顯示，THC可顯著減輕角叉菜膠誘導的大鼠足腫脹、二甲苯誘導的小鼠耳腫脹，提示其具有一定的體內抗炎作用[4]。基于此，本研究采用硝酸還原酶法、酶聯免疫吸附分析（ELISA）、實時熒光定量PCR（qPCR）法探討THC的體外抗炎機理，為其進一步開發研究提供實驗依據。現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級健康雌性昆明種小鼠，20～25 g，由西安交通大學動物中心提供，動物質量合格證號：SYXK（陜）2015-002。

1.2 主要藥物與試劑 THC，購自寶雞市辰光生物工程有限公司，含量＞98%。胎牛血清（民海生物工程有限公司）；RPMI-1640培養基（美國Gibco公司）；巰基乙醇酸鈉（國藥集團化學試劑有限公司）；脂多糖（LPS，美國Sigma公司）；四甲基偶氮唑鹽（MTT，美國Sigma公司）；腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）ELISA試劑盒（美國Rapidbio公司）；一氧化氮（NO）試劑盒（南京建成生物科技有限公司）；核蛋白提取試劑盒（美國Millipore公司）；核因子kappaB（NF-κB）p65試劑盒（上海Active Motif公司）；二甲基亞砜（DMSO，美國Pierce公司）。

1.3 主要儀器 ASS150A型超聲震蕩儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；XDS-1B型倒置顯微鏡（重慶光電儀器有限公司）；Sigma 2-16PK高速離心機（德國Sigma公司）；SP-2102UV型紫外可見分光光度儀（上海光譜儀器有限公司）；Bio-TekELX800型全自動酶標儀（美國BioTek公司）。

1.4 觀察指標與方法

1.4.1 小鼠腹腔巨噬細胞的原代培養及鑒定 給予小鼠腹腔注射1.5～2.0 mL巰基乙醇酸鈉溶液，連續注射7 d后，脫臼處死；于體積分數75%乙醇溶液中浸泡5 min，無菌條件下腹腔注射預冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）5 mL，輕揉小鼠腹部約5 min，靜置5 min；注射器抽取腹腔液約4 mL，收集的腹腔液4℃以1 000 r/min離心5 min，倒去上清，PBS洗滌2次；富集的小鼠腹腔巨噬細胞用含有胎牛血清的RPMI-1640培養液稀釋后置于37℃、體積分數為5%的CO2培養箱中培養，經細胞形態學及CD68免疫組化染色對分離的小鼠腹腔巨噬細胞進行鑒定。

1.4.2 MTT法檢測巨噬細胞活性 為考察THC對小鼠原代腹腔巨噬細胞活性的影響，取“1.4.1”項下細胞，以1×105個/mL的密度接種于96孔板，每孔100 μL。實驗設空白對照組，模型對照組，THC低、中、高劑量組，每組6個復孔。孵育24 h后，各組細胞分別加入THC母液，調整使THC終濃度分別為1、2、3 μmol/L，空白對照組和模型對照組加入相應體積的細胞培養液，繼續孵育24 h，每孔加入20 μL新配制的5 g/L的MTT，培養4 h，棄上清，每孔加150 μL DMSO，振動10 min后使甲瓚充分溶解。于560 nm處測吸光度[D（λ）]，計算細胞存活率：細胞存活率（p/%）=[THC組D（λ）值-空白對照組D（λ）值]/[模型對照組D（λ）值-空白對照組D（λ）值]×100%。

1.4.3 硝酸還原酶法檢測NO含量 取“1.4.1”項下細胞，以1×105個/mL密度接種于24孔板，與不同濃度的THC共培養24 h。孵育結束后，THC低、中、高劑量組和模型對照組加入LPS（終濃度為10 μg/mL），空白對照組加入相應體積的培養液，繼續培養12 h，收集上清液，具體步驟按照NO試劑盒說明書操作。于540 nm處測吸光值[D（λ）]，并計算NO的含量及抑制率。公式：NO含量[c/（μmol·L-1）]=[測定管平均D（λ）值-空白管平均D（λ）值]/[標準管平均D（λ）值-空白管平均D（λ）值]×標準品濃度×樣品稀釋倍數。NO抑制率（p/%）=[模型對照組NO平均含量-給藥組NO平均含量]/模型對照組NO平均含量×100%。

1.4.4 qPCR法檢測TNF-α、IL-6 mRNA的表達細胞培養與處理同“1.4.3”項，收集各組細胞，分別提取細胞內總RNA，按照反轉錄試劑盒說明書的步驟將RNA反轉成cDNA，應用上述逆轉錄的cDNA進行qPCR檢測。TNF-α上游引物序列：5’-TTCTGTCCCTTTCACTCACTGG-3’，下游引物序 列 ： 5’-TTGGTGGTTTGCTACGACGTGG-3’；IL-6上游引物序列：5’-GTACTCCAGAAGAC CAGAGG-3’，下游引物序列：5’-TGCTGGTGAC AACCACGGCC-3’；β-actin上游引物序列：5’-AGGGAAATCGTGCGTGACATCAAA-3’，下游引物序列： 5’-ACTCATCGTACTCCTGCTTGCTGA-3’。PCR反應條件：反應總體積25 μL，10×緩沖液2.5 μL，Taq DNA 聚合酶 0.5 μL，上游引物 0.8 μL，下游引物0.8 μL，10 mmol/L dNTP Mix 1 μL，模板1 μL，雙蒸水補足25 μL。預變性（94 ℃ 5 min），PCR擴增（94℃30 s；60℃ 30 s；72℃30 s；35個循環）。延伸時讀取吸光度值，采用最大二階導數法對數據進行統計，計算TNF-α、IL-6 mRNA的相對表達量（p）。

1.4.5 ELISA法檢測TNF-α和IL-6含量 細胞培養與處理同“1.4.3”，收集細胞上清液，按照ELISA試劑盒說明書于450 nm處測吸光值[D（λ）]，繪制標準曲線，計算TNF-α和IL-6的含量及抑制率。TNF-α抑制率（p/%）=（模型對照組TNF-α平均含量-給藥組TNF-α平均含量）/模型對照組TNF-α平均含量×100%。IL-6抑制率（p/%）=（模型對照組IL-6平均含量-給藥組IL-6平均含量）/模型對照組IL-6平均含量×100%。

1.4.6 THC對NF-κBp65活性的影響 細胞培養與處理同“1.4.3”項，小鼠腹腔巨噬細胞核蛋白提取過程如下：參照核蛋白提取試劑盒說明書，收集各組細胞于Eppendorf管中，4℃300 r/min離心5 min，PBS洗滌2次，棄去上清，加入胞漿裂解液，混勻細胞，置于冰上15 min，4℃250 r/min離心15 min，棄去上清；再次加入胞漿裂解液，輕輕吹打混勻細胞，4℃8 000 r/min離心20 min，棄去上清，沉淀于搖床冰上低速搖晃60 min，4℃16 000 r/min離心5 min，上清即為細胞核蛋白，二喹啉甲酸（BCA）法測定核蛋白濃度，-80℃儲存待用。NF-κBp65 DNA活性測定過程參照試劑盒說明書，首先向各檢測孔中加入試劑盒自帶試劑，再加入含有相同質量的各樣本核蛋白提取物20 μL，室溫下搖床孵育60 min，依次加入一抗NF-κBp65以及辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗，室溫孵育后加入顯色劑以及終止液，并在5 min后于450 nm處測量吸光度[D（λ）]。根據標準品濃度及其所對應的吸光度值，繪制標準曲線，結合樣本的吸光度值，計算相應測試樣品的濃度。

1.5 統計方法 作圖及統計分析均使用GraphPad prism 5統計軟件，計量資料以均數±標準差(-x±s)表示，多組間比較采用單因素方差（one-way ANOVO）分析及t檢驗，每項實驗至少獨立重復3次，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠腹腔巨噬細胞的原代培養及鑒定 小鼠腹腔提取的巨噬細胞經原代培養后，于顯微鏡下觀察，其大小在20～50 μm之間，多數細胞呈梭型或星型，少部分為圓形；經CD68免疫組織化學染色，細胞呈棕色，表明分離培養的細胞為巨噬細胞。

2.2 THC對小鼠原代腹腔巨噬細胞活性的影響 圖1結果顯示，THC低、中、高劑量組細胞活性與模型對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），表明1～3 μmol/L范圍內的THC對小鼠原代腹腔巨噬細胞活性無影響。

圖1 THC對小鼠原代腹腔巨噬細胞活性的影響Figure 1 Effects of THC on the activity of mouse primary macrophages isolated from the abdominal cavity

2.3 THC對巨噬細胞分泌NO的影響 表1結果顯示：與空白對照組比較，模型對照組NO含量增加（P＜0.001）；與模型對照組比較，THC低、中、高劑量組NO含量顯著減少，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01或P＜0.001），且隨著THC劑量的增加，NO的分泌逐漸減少。表明LPS能顯著誘導巨噬細胞分泌NO，說明模型制備成功，給予不同濃度的THC干預后，NO的分泌被顯著抑制，且呈劑量相關性。

表1 THC對小鼠巨噬細胞分泌NO的影響Table 1 Effects of THC on the secretion of NO from mouse macrophages (-x±s)

2.4 THC對巨噬細胞TNF-α、IL-6 mRNA表達的影響 圖2結果顯示：模型對照組TNF-α、IL-6 mRNA表達水平較空白對照組顯著升高（P＜0.001）；THC低、中、高劑量組TNF-α、IL-6 mRNA表達水平明顯低于模型對照組，差異有統計學意義（P＜0.01或P＜0.001），且隨著THC劑量的增加，TNF-α、IL-6 mRNA表達下降。表明巨噬細胞TNF-α、IL-6 mRNA表達可被THC顯著抑制，且具有劑量相關性。

圖2 THC對小鼠原代腹腔巨噬細胞TNF-α與IL-6 mRNA表達的影響 (-x±s)Figure 2 Effects of THC on mRNA expression levels of TNF-α and IL-6 in mouse primary macrophages isolated from the abdominal cavity

2.5 THC對巨噬細胞分泌TNF-α與IL-6的影響 表2結果顯示：模型對照組TNF-α與IL-6含量較空白對照組顯著增加（P＜0.001）；與模型對照組比較，THC低、中、高劑量組TNF-α與IL-6含量較模型對照組顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01或P＜0.001）。表明經不同濃度的THC干預后，小鼠腹腔巨噬細胞產生TNF-α與IL-6的能力可得到不同程度的抑制，且呈劑量相關性。

2.6 THC對NF-κBp65 DNA結合活性的影響 表3結果顯示：模型對照組NF-κBp65 DNA結合活性較空白對照組顯著上調（P＜0.001）；THC低、中、高劑量組NF-κBp65 DNA結合活性明顯低于模型對照組，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.001），且隨著THC劑量的增加，NF-κBp65 DNA結合活性顯著性降低。表明經不同濃度的THC干預后，小鼠腹腔巨噬細胞NF-κBp65 DNA結合活性被抑制，且呈劑量相關性。

表2 THC對LPS誘導小鼠腹腔巨噬細胞分泌TNF-α、IL-6的影響Table 2 Effects of THC on secretion of TNF-α and IL-6 from mouse primary macrophages isolated from the abdominal cavity induced by LPS (-x±s)

表3 THC對LPS誘導巨噬細胞中NF-κBp65 DNA結合活性的影響Table 3 Effects of THC on the activity of NF-κBp65 binding to DNA in mouse macrophages induced by LPS (-x±s)

3 討論

藥物對促炎因子的抑制作用通常是由以下2種情況造成的：一是藥物的毒性影響了細胞的正常生長，使細胞數量及功能下降，從而使促炎因子的表達減少，但這種減少與藥效無關；二是藥物影響了信號通路從而抑制促炎因子的產生，進而發揮抗炎作用，此為藥物的真實藥效表現。故在藥物無毒劑量下進行實驗是考察藥物藥效的基礎[5]。MTT法由Mosmann T[6]于1983年首先提出，后經Tada H等[7]人多次改進，該方法具有簡單、快速、經濟、無放射性污染等優點，是一種能與放射活性檢測法相媲美的細胞毒性檢測方法。本實驗MTT結果顯示，THC在1～3 μmol/L范圍內對小鼠腹腔巨噬細胞沒有明顯的細胞毒性，此藥物濃度為后續實驗真實反映THC的抗炎作用提供了保障。

脂多糖（LPS）是革蘭氏陰性菌細胞壁主要成分之一，可有效激活巨噬細胞內相應的轉錄因子，從而使相關炎性基因和蛋白的表達發生改變，促使巨噬細胞合成并分泌多種炎性因子如TNF-α、NO、IL-6和MCP-1等[8，9]。本研究結果顯示，LPS可顯著誘導巨噬細胞分泌IL-6、TNF-α和NO，表明其可成功構建體外炎癥模型。

NO是一種新型的多功能氣體小分子神經遞質，同時也是活性較高的自由基，在各種生化過程當中起著關鍵的作用。研究表明，多種急慢性炎癥的發生發展均與NO有關，其在炎癥反應中有著雙重作用：在生理狀態下，NO維持著一定的濃度，能夠傳遞細胞外信號，進而調節多種細胞功能；在病理狀態下，NO水平通常會發生變化，過量的NO能夠促進炎癥的反應，并對機體造成損傷，如類風濕關節炎患者體內NO的水平明顯升高[10]。本研究發現，LPS單獨處理可促進小鼠巨噬細胞表達和分泌NO，而THC預處理則可抑制NO的過度分泌。

TNF-α是炎癥發生時機體內最先出現并具有核心作用的炎癥介質，是一種具有多效生物學作用的細胞因子[11]。研究發現，當機體受到LPS刺激時，肝臟、心臟、輸卵管以及子宮等多個臟器可迅速大量地合成TNF-α，進而加強中性粒細胞的趨化作用，并與機體隨后合成的細胞因子IL-1、IL-6等協同作用，激發炎癥級聯反應[12-14]。本研究結果顯示，THC預處理可顯著抑制LPS誘導巨噬細胞分泌TNF-α。

IL-6是一種多功能細胞因子，也是誘導炎癥反應的重要因素，通常能與其他炎性因子起到協同作用，放大炎癥反應從而對機體造成損傷，因此IL-6水平可作為判斷炎癥反應程度的指標[15-17]。本研究結果顯示，LPS刺激可促進巨噬細胞表達和分泌IL-6，而THC預處理則可抑制IL-6的表達和分泌，此結果進一步驗證了THC具有良好的體外抗炎作用。

NF-κB是最先在人類B淋巴細胞中發現的一種核蛋白因子，具有多向轉錄調節作用，在炎癥反應中發揮著重要作用。NF-κB廣泛存在于機體各種類型的細胞中，在細胞靜息狀態下，NF-κB與其抑制物IκB非共價結合而存在于細胞質中，此時的NF-κB不表現出轉錄活性；當細胞受到外界刺激時，IκB會發生磷酸化，從IκB與p65、NF-κBp50二聚體復合物上脫離并暴露出入核信號，從細胞質進入到細胞核，結合特定的DNA基因序列，誘導靶基因的轉錄，通過不同的信號通路來調節趨化因子、細胞因子、粘附分子、生長因子等的表達，從而影響機體的多種生物學功能[18-20]。為明確THC的抗炎作用是否與NF-κB信號轉導通路有關，本課題組首先對此通路中的關鍵分子NF-κBp65進行了檢測，結果顯示LPS可以顯著誘導NF-κBp65與DNA的結合活性，而THC預處理能夠有效抑制活性的增加。

綜上所述，THC對LPS誘導的小鼠腹腔巨噬細胞分泌TNF-α、NO、IL-6等炎癥因子及NF-κBp65活性有顯著的抑制作用，表明THC在細胞水平具有抗炎活性，且其體外抗炎作用可能與阻斷細胞內NF-κB信號通路的激活從而下調促炎因子的表達和分泌有關。