3種方法構建BALB/c裸鼠BEL-7402人肝癌模型

王諾，姚嘉琪，王弋，梁秋玲，饒子亮，鄺少松

（廣東省醫學實驗動物中心，廣東佛山 528248）

原發性肝癌是世界上最常見且惡性程度最高的腫瘤之一，發病率在惡性腫瘤中居世界第5位，病死率居第3位[1]，患病人數已超過62.6萬/年，死亡人數接近60萬/年[2]。采用動物肝臟移植瘤模型進行肝癌的機理研究已成為研究熱點。有文獻報道，胡敏等[3]采用腫瘤細胞皮下接種法建立裸鼠肝癌模型，沈艷等[4]采用瘤塊種植法建立裸鼠肝癌模型。為更好地應用肝癌腫瘤模型進行臨床研究及抗腫瘤藥物篩選，本研究采用細胞注射、瘤塊種植的方法建立BALB/C裸鼠BEL-7402人肝癌腫瘤模型，觀察BALB/C裸鼠腫瘤生長效果。現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 53只BALB/c裸鼠，SPF級，雄性，6～8周，體質量17.8～21.5 g，由廣東省醫學實驗動物中心生產科饋贈，許可證號：SCXK（粵）2013-0002。本實驗研究經過廣東省醫學實驗動物中心實驗動物倫理委員會審查通過。

1.2 飼養環境 動物飼養于廣東省醫學實驗動物中心SPF級實驗動物室，實驗動物使用許可證號：SYXK（粵）2013-0002。動物飼養條件：2～5 只/箱，群養，飼養溫度20～26℃，濕度40%～70%，采用10 h∶14 h晝夜間斷照明。飼養室條件始終保持穩定，以保證實驗結果的可靠性。飼料為廣東省醫學實驗動物中心提供的全價顆粒飼料；飲水為廣東省醫學實驗動物中心提供的純凈水，以飲水瓶自由攝取。

1.3 細胞來源 BEL-7402人肝癌細胞來源于在廣東省醫學實驗動物中心細胞庫。

1.4 主要試劑與儀器 1640培養液（批號：8117121，美國Gibco公司產品）；胎牛血清（批號：42F3352K，美國Gibco公司產品）；Matrigel Matrix（批號：5306009，Corning公司產品）。CKX41型倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司產品）；311型恒溫CO2孵箱（美國Thermo產品）；BS-3000A型電子天平（上海友聲衡器有限公司產品）；BS224S型萬分之一天平（德國Sartorius公司）；0-150型游標卡尺（上海臺海工量具有限公司）；RM2135型輪轉切片機（德國徠卡公司）；Olympus BX41型熒光病理圖像分析系（日本奧林巴斯公司）；HMIAS-2000型高清晰度彩色醫學圖文分析系統（武漢千屏影像技術有限責任公司）。

1.5 細胞培養及瘤塊制備 ①細胞培養：BEL-7402人肝癌細胞使用1640完全培養液于100 mm培養皿中培養。細胞長至80%～90%融合時，棄去原培養液，以0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次，2.5 g/L胰酶消化2 min；吸去胰酶，加入培養液，1傳3。取對數生長期BEL-7402人肝癌細胞，經臺盼藍染色計數活細胞，用PBS配成密度為1.0×107個/mL的細胞懸液，置于冰上。②瘤塊制備：予2只裸鼠左側背部皮下注射0.2 mL細胞懸液，待動物腫瘤直徑長至約1 cm時處死裸鼠，切下瘤塊除去壞死部分，選用淡黃色或呈魚肉狀瘤組織置于PBS中剪成直徑約為1 mm的瘤塊備用。

1.6 3種方法建立BALB/c裸鼠肝癌腫瘤模型 將檢疫合格的51只SPF級BALB/c裸鼠按體質量隨機分為A、B、C 3組，每組17只。A組動物于左側背部皮下注射0.2 mL密度1.0×107個/mL的BEL-7402人肝癌細胞。B組先將細胞懸液濃縮至密度為4.0× 107個/mL，與Matrigel Matrix按體積1∶1混合，置于冰上低溫短暫保存；B組動物按每10 g體質量0.08 mL腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉后，依次用碘酒、酒精消毒皮膚，左上腹做一橫切口，暴露肝臟，用一次性使用無菌注射器注射0.1 mL與Matri?gel Matrix混合的密度為2.0×107個/mL BEL-7402人肝癌細胞于裸鼠肝右葉，立即用無菌紗布按壓針孔至肝臟表面不再滲血。C組動物按照B組手術方式暴露肝臟后，用鑷子將直徑約1 mm的BEL-7402人肝癌腫瘤瘤塊植入裸鼠肝右葉深部實質內，迅速拔出鑷子后立即用無菌紗布按壓至肝臟表面不再滲血。B、C組動物逐層縫合腹膜（含肌層）和皮膚。清洗創口，并用碘酒消毒。術后所有裸鼠暫時分籠，37℃保溫飼養直至完全蘇醒，整個手術過程控制在細胞消化、切除皮下瘤后2 h內完成。

1.7 觀察指標與方法 每天觀察動物一般癥狀；從接種開始第2周至第5周，每周測定BALB/c裸鼠體質量，每組隨機各取3只動物麻醉處死，解剖取腫瘤，剝離干凈后用游標卡尺分別測量瘤體長徑 a 和短徑 b，計算腫瘤體積[公式：V=1/2（ab2）]，稱量瘤塊質量；于接種第5周后觀察記錄各組剩余動物（5只/組）存活天數；組織病理學檢查：解剖所取腫瘤經體積分數10%甲醛固定，常規切片制作，蘇木素—伊紅（HE）染色，進行組織病理學檢查。

1.8 統計方法 采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較采用重復測量方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 造模后動物一般狀態 皮下接種BEL-7402人肝癌細胞5 d后，A組17只裸鼠左側背部均長出腫瘤。接種1周后，皮下觸摸B組和C組動物腹部肝臟部位，均有異物感。各組動物從接種開始至接種第5周，腫瘤日漸生長（見圖1-a、b、c），動物體態、黏膜、自主活動等表現均未見異常改變，口、眼、耳、鼻均未見異常分泌物，大便無稀爛，尿量未見異常，尿液澄清透明。后期各組剩余動物從接種開始至第6周動物一般狀態觀察未見異常。從接種第7周開始A組動物逐漸出現形體消瘦，瘤體破潰、表面結痂癥狀；B、C組動物出現形體明顯消瘦，腹部隆起癥狀（圖1-d）；后期A、B、C組動物均逐漸出現嗜睡、精神萎靡不振、步態匍匐行走、尿液渾濁、肌肉張力松弛、呼吸微弱直至暫停癥狀。

圖1 造模后動物一般狀態觀察Figure 1 Macroscopical appearance of the modeled animals

2.2 動物體質量、腫瘤大小及腫瘤質量的變化接種腫瘤第2周至第5周，測量各組BALB/c裸鼠體質量。表1結果顯示，與A組動物比較，B、C組動物生長較緩慢，體質量顯著降低（P＜0.05），可能是由于B、C組動物手術失血引起，也可能是B、C組動物腫瘤于肝臟原位生長，吸取過多營養，對動物影響較大引起。

表1 各組BALB/C裸鼠體質量的變化Table 1 Comparison of the change of body mass of BALB/C nude mice in various groups （，m/g）

表1 各組BALB/C裸鼠體質量的變化Table 1 Comparison of the change of body mass of BALB/C nude mice in various groups （，m/g）

①P＜0.05，與A組比較

組別A組B組C組t=5周（n=8）26.1±2.7 24.4±2.4①25.5±1.9 t=2周（n=17）20.2±1.7 19.1±1.2 18.7±1.8 t=3周（n=14）21.5±1.5 19.5± 2.4①20.2±1.3 t=4周（n=11）24.3±2.2 21.5±1.3①22.3±2.3①

接種腫瘤第2周至第5周，每組隨機各取3只動物麻醉處死，解剖取腫瘤，仔細剝離，去除除腫瘤之外的其他組織，測量腫瘤大小和質量。表2結果顯示，B、C組動物腫瘤體積較A組動物顯著增大（P＜0.05），可能是腫瘤于肝臟原位生長，供血充足所致。表3結果顯示：C組腫瘤質量顯著增大（P＜0.05），并且C組動物腫瘤在接種第4周至接種第5周生長最快，可能是腫瘤已在裸鼠體內適應其生長環境；A組17只裸鼠左側背部均長出腫瘤；經后續解剖發現B、C 2組原位接種的34只裸鼠肝臟部位均長出腫瘤。A、B、C 3組動物成瘤率均為100%。

表2 A、B、C組BALB/C裸鼠腫瘤體積大小的變化Table 2 Comparison of the change of volume size of BALB/C nude mice in various groups （，V/mm3）

表2 A、B、C組BALB/C裸鼠腫瘤體積大小的變化Table 2 Comparison of the change of volume size of BALB/C nude mice in various groups （，V/mm3）

①P＜0.05，與A組比較

組別A組B組C組t=5周501.9±100.4 616.3±196.8①758.1±199.2①n3 3 3 t=2周18.3±5.1 35.6±9.6 27.9±8.0 t=3周87.7±16.2 106.5±20.3 94.5±18.1 t=4周249.8±40.1 264.8±44.3 346.2±73.2①

表3 A、B、C組BALB/C裸鼠腫瘤質量的變化Table 3 Comparison of the change of tumor mass of BALB/C nude mice in various groups （，m/g）

表3 A、B、C組BALB/C裸鼠腫瘤質量的變化Table 3 Comparison of the change of tumor mass of BALB/C nude mice in various groups （，m/g）

①P＜0.05，與A組比較

組別A組B組C組t=5周0.601 1±0.154 6 0.671 8±0.112 4 0.723 6±0.187 9①n3 3 3 t=2周0.082 5±0.007 3 0.131 9±0.005 2 0.125 6±0.018 6 t=3周0.149 2±0.004 5 0.180 6±0.012 6 0.157 2±0.038 3 t=4周0.402 3±0.120 1 0.468 3±0.189 7 0.502 2±0.146 5①

圖2 死亡動物腹腔內器官黏連情況及腫瘤組織病理學觀察Figure 2 The adhesion status of abdominal organs and pathological feature of tumor tissues in dead animals

2.3 動物存活天數 A組動物于接種80 d開始出現死亡，接種103 d最后1只動物死亡，平均存活天數為（90.8±10.2）d；B組動物于接種61 d開始出現死亡，接種95 d最后1只動物死亡，平均存活天數為（75.6±14.0）d；C組動物于接種54 d開始出現死亡，接種83 d最后1只動物死亡，平均存活天數為（67.4± 11.1）d。

2.4 后期死亡動物腹腔內器官粘連情況及腫瘤組織病理學觀察 后期死亡動物經解剖發現：A組有1只動物出現腹腔內器官粘連；B組和C組各有4只動物出現大量腹水（見圖2-a），腹腔內器官粘連（見圖2-b），B組1只動物死亡解剖時發現肝臟呈黃色（見圖2-c），腸、胃出現結節，分析其原因可能是在進行裸鼠肝右葉細胞注射時出現失誤，造成細胞逃逸，導致腫瘤細胞種植性轉移。

腫瘤組織病理學觀察：解剖所取腫瘤呈結節狀。腫瘤組織經體積分數10%甲醛固定，常規切片制作，HE染色，鏡下可見腫瘤細胞呈一定方向排列，細胞呈梭形、多邊形，異型明顯，可見核分裂（見圖2-d）。

3 討論

腫瘤分為良性腫瘤和惡性腫瘤，惡性腫瘤（malignant tumors）具有生長迅速、侵襲性強，易從原發部位播散到身體其他部位，死亡率高等特點[5]。原發性肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，死亡率居惡性腫瘤第2位[6，7]。惡性腫瘤嚴重威脅著人類的生命，因此，對惡性腫瘤的研究一直以來都是醫學研究最熱門的領域之一[8]。腫瘤移植瘤模型的建立，為人類更好地研究腫瘤轉移機制和抗腫瘤藥物的篩選提供了理想的工具。它維持了原有腫瘤生物學特征，在宿主體內能顯示類似于人類腫瘤體內的惡性行為與特征。原位移植腫瘤動物模型的建立是將腫瘤細胞移植到該腫瘤的源發器官。提供該腫瘤細胞與其起源相同的體內微環境，保持腫瘤細胞原有的生物學特性，具有高度的臨床相關性[9]。1969年Rygaard J[10]通過實驗證實裸鼠由于先天性胸腺發育不良，致T細胞生成障礙，細胞免疫功能缺陷，從而在理論上保證了人癌裸鼠移植的可能性。經過眾多學者們的不斷探索，人肝癌裸鼠腫瘤模型已經比較成熟，但仍會有成瘤率不高、難以連續傳代等問題出現。人肝癌細胞特性、裸鼠的品系、裸鼠的年齡大小、裸鼠的生活環境和腫瘤移植部位等，這些都是影響裸鼠腫瘤建模的關鍵因素。

BEL-7402人肝癌細胞株是由我國陳瑞銘于1974年建立[11，12]，來源于一位53歲男性肝癌患者的手術切除標本。BEL-7402人肝癌細胞增長快速，傳代1次只需2～3 d，呈貼壁生長，細胞形態呈多邊形上皮樣。其細胞染色體中有一大而長的近端著絲點染色體，出現頻率高，是BEL-7402人肝癌細胞株的標記染色體；甲胎蛋白（AFP）免疫熒光反應陽性；LDH、G6PD、TAT等酶代謝及細胞的超微結構基本上保持臨床人體肝癌的特性[13]。本研究選取6～8周齡雄性BALB/c裸鼠，飼養和實驗環境均在SPF級屏障設施內，采用BALB/c裸鼠皮下和肝臟原位注射BEL-7402人肝癌細胞，以及肝臟原位種植BEL-7402人肝癌細胞腫瘤瘤塊，結果顯示，這3種方法建立腫瘤模型成功率高，提示均可作為藥物抑制率模型。本研究中BALB/c裸鼠的體質量、腫瘤大小、腫瘤質量，以及BALB/c腫瘤裸鼠的生存時間等基礎數據，可為肝癌腫瘤模型造模方法的選擇以及抗肝癌腫瘤藥物篩選中抗腫瘤藥物開始給藥時間和持續給藥時間的選擇等方面提供參考。

但在腫瘤種植過程中需注意3個方面的問題：①在細胞懸液和瘤塊制備過程中應嚴格注意無菌環境，最好在超凈工作臺、點燃酒精燈的環境下操作；②注射細胞懸液和種植瘤塊至裸鼠肝右葉時需技術嫻熟，小心謹慎，防止刺穿肝臟，造成細胞或瘤塊逃逸，導致腫瘤細胞種植性轉移；③待接種的細胞和瘤塊需置于冰上，整個接種手術過程控制在細胞消化、切除皮下瘤后2 h內完成，以保證細胞和瘤塊的活性。

綜上所述，本研究建立了3種簡便易行、生長良好、成本較低的BALB/c裸鼠BEL-7402人肝癌腫瘤模型，具有可復制性、穩定性和較高成功率，便于推廣使用。