水體亞硝酸氮的試劑盒定量測定方法

黃海洪，朱艷蘭，類延菊，陳靈靈，楊品紅

(湖南文理學院 生命與環境科學學院, 湖南 常德 415000)

0 引 言

氮元素的累積是水體富營養化的重要原因[1]。尤其是在水產養殖中，由于使用大量的人工配合飼料，而利用率卻比較低，大部分(約75%，以飼料蛋白氮計算)都流失到了水體[2]，最終轉化為無機氮，極易被藻類吸收利用，引起過度繁殖。亞硝酸氮是該過程的重要中間產物[3]，具有較強的生物毒性[4]，因而是水環境保護和水產養殖等領域一項重要的監測指標[5-6]。

目前，水體亞硝酸氮的測定以及教學實驗一般采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法[7-8]，但是試劑配制比較復雜，操作也較為繁瑣。針對亞硝酸氮的測定也開發了商品化的檢測試劑盒[9-11]，試劑用量少，容易保存，操作安全、簡單，且價格低廉，在生產實踐中得到了廣泛應用，但是一般只用于定性或半定量的分析，定量測定方面受到的關注較少。本文根據亞硝酸氮常用的分光光度法[9]的測定原理，對商品化試劑盒測定亞硝酸氮的方法進行改良，以期為水體亞硝酸氮的快速測定以及教學實驗的開展提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.2 亞硝酸氮標準溶液制備

亞硝酸氮標準溶液參照文獻[8]中所述方法配制，稍作修改。亞硝酸鈉在100～105 ℃下干燥2 h，稱重，溶于蒸餾水中，容量瓶定容、稀釋，配制不同亞硝酸氮濃度的標準樣品溶液。

1.3 樣品處理

樣品的處理參照試劑盒操作說明(www.apifishcare.com)進行，稍作修改。取1 mL樣品溶液，加入顯色劑，混勻，制備顯色反應液。靜置5 min，待顏色形成并穩定，加入2 mL蒸餾水，混勻，備用以測定吸光度。以蒸餾水為空白對照，按上述步驟制備空白顯色反應液。

1.4 測定條件優化

(1)吸收波長的確定。在380～700 nm波長范圍內，對標準樣品溶液和空白對照的顯色反應液吸光度進行掃描，以空白顯色反應液作為對照，選取使樣品顯色反應液吸光度大,而空白顯色反應液吸光度小的波長，作為測定波長。

(2)顯色劑用量的選擇。分別用40～360 μL顯色劑處理標準樣品溶液，制備顯色劑用量不同的反應液，測定吸光度，選取使反應液吸光度大且處于穩定狀態的體積，作為顯色劑的用量。

1.5 吸光度測定以及回歸方程擬合

不同濃度的亞硝酸氮標準樣品溶液各取1 mL，按照試劑盒處理方法制備顯色反應液，在優化的顯色劑用量、吸收波長等參數條件下，測定吸光度。然后以吸光度為橫坐標、亞硝酸氮濃度為縱坐標，應用CurveExpert 2.0軟件(www.curveexpert.net)繪制標準曲線，擬合回歸方程。

1.6 回收率和相對標準偏差計算

標準樣品溶液用試劑盒處理，測定吸光度，根據回歸方程計算樣品亞硝酸氮濃度的理論值，與真實濃度進行比較，按下式計算樣品的回收率[7]：

(1)

式中：R為回收率；ρt為標準樣品溶液真實亞硝酸氮濃度;ρd為根據回歸方程理論計算的亞硝酸氮濃度，mg/L。

測量值相對真實值的標準偏差(相對標準偏差)參照文獻[7]所述方法計算，但是本研究的測量值是未設置重復的數據，因此根據文獻[12]稍作修改,計算公式如下：

(2)

式中:n為標準樣品溶液的數量，n≥2；i= 1，2，…，n；ρti和ρdi分別表示第i個標準樣品溶液亞硝酸氮的真實濃度和測量濃度，mg/L。

1.7 含氮物質對亞硝酸氮測定的影響

參照亞硝酸氮標準樣品溶液的配制方法，分別制備硝酸鈉、氯化銨和大豆蛋白胨標準溶液，然后用亞硝酸氮檢測試劑盒進行處理，制備顯色反應液，測定吸光度，根據回歸方程計算亞硝酸氮濃度，作為由其他含氮物質對亞硝酸氮測定造成的誤差濃度，以此研究硝酸氮、氨氮和有機氮等對亞硝酸氮測定的影響。

1.8 統計分析

應用卡方檢驗方法檢查測量值與真實值的差異顯著性[12]，通過調用Excel CHISQ.TEST程序實現，P< 0.05為差異顯著。

2 結果與討論

2.1 測定條件

分別測定了1.08 mg/L亞硝酸氮標準樣品溶液和空白對照顯色反應液在380～700 nm波長范圍內的吸光度(圖1(a))。結果顯示，亞硝酸氮樣品的顯色反應液在620 nm 處具有最大吸收峰，在540 nm處也有一個較小的吸收峰。但是空白顯色反應液在620 nm處也具有單一最大吸光度，且在380～440 nm和600～700 nm范圍內，與樣品溶液顯色反應液的吸光度相差不大。從460 nm開始，樣品溶液與空白對照顯色反應液的吸光度差別逐漸增大，在540 nm處達到最大，說明此時顯色劑對樣品溶液的干擾最小。

圖1 波長(a)與顯色劑用量(b)對樣品反應液吸光度的影響

不同顯色劑用量條件下0.76和2.15 mg/L兩種亞硝酸氮樣品的吸光度變化見圖1 (b)。結果顯示，兩種樣品溶液均在顯色劑用量為200 μL的條件下，達到較高的吸光度，并趨于穩定。

檢測試劑盒與分光光度計都是依據比色的原理進行工作，為兩種方法的結合應用奠定了基礎。但是試劑盒依據肉眼判斷進行比色，不夠精確。因此，使用試劑盒進行定量測定，需要輔以分光光度計進行精確的吸光度測定。首先要確定最佳的吸收波長，使顯色反應液的吸光度最大，提高檢測靈敏度，同時使顯色劑的干擾最小，檢測準確度最優,其次要確定顯色劑的用量，使樣品充分顯色，但是也要控制用量以減小顯色劑的干擾[13-15]。根據上述原則，確定540 nm為測定亞硝酸氮濃度的最佳吸收波長，這與重氮-偶氮光度法的吸收波長(543 nm)大致相同[8]。從樣品充分顯色和減小干擾的角度綜合考慮，采用200 μL作為最適的顯色劑用量，遠遠低于其他常用方法的用量[7, 8]。

2.2 標準曲線與回歸方程

按照試劑盒處理樣品的方法，在顯色劑用量為200 μL，波長為540 nm條件下，分別測定了8.60、4.30、2.15、1.08、0.54、0.27、0.13和0.07 mg/L標準樣品溶液顯色反應液的吸光度，然后以吸光度為自變量、亞硝酸氮濃度為因變量，繪制了標準曲線(見圖2)，擬合的回歸方程為：

ρ=0.033 7+4.283 5a

r=0.999 8,P<0.01

(3)

式中:ρ為亞硝酸氮濃度;a為吸光度;r相關系數。回歸方程極顯著(P<0.01)，濃度與吸光度的相關系數0.999 8，表明亞硝酸氮濃度與吸光度具有非常好的線性關系，應用檢測試劑盒定量測定硝酸氮含量的方法是可行的。但是，回歸方程的常數項大于0(0.033 7)，說明該方法具有測量下限。本研究使用的分光光度計能夠讀出的最小吸光度為0.001，此時根據回歸方程計算可得硝酸氮濃度為0.04 mg/L，可作為本方法的測量下限。Lambert-Beer定律表明吸光度不超過1.0時，濃度與吸光度具有較好的線性關系[14]。因此，假定吸光度為1.0，通過回歸方程計算得到硝酸氮濃度為4.32 mg/L，可作為本方法的測量上限。

N-(1-萘基)-乙二胺光度法的測量范圍為0.003～0.20 mg/L[7]，邊超等[11]研制的水體亞硝酸氮的現場快速測定方法測量范圍為0.01～0.20 mg/L，而本文所述方法測量范圍為0.04～4.32 mg/L，可能是由于采用的測定試劑不一致造成的。根據說明書，該試劑盒能夠識別的硝酸氮最大濃度為5.00 mg/L(www.apifishcare.com)，與本法的測量上限(4.32 mg/L)接近。

圖2 吸光度與亞硝酸氮濃度標準曲線

2.3 回收率與測定偏差

測定了濃度分別為0.64、0.96、1.90、3.80、7.60和15.20 mg/L樣品溶液的吸光度，根據回歸方程得到理論濃度，并計算了回收率。由表1可知，濃度為0.64～3.80 mg/L的樣品在本研究方法測定下限和上限范圍(0.04～4.32 mg/L)之內，亞硝酸氮的回收率為99.00%～105.61%，相對偏差為 ± 4.54%，符合亞硝酸氮監測的實驗室質量控制指標范圍(亞硝酸氮濃度 > 0.2 mg/L，回收率95%～105%，偏差 ≤± 5%)[7]，卡方檢驗結果也顯示測量值與真實值差異不顯著(P= 0.999 5)。當濃度高于測定上限(> 4.32 mg/L)，雖然濃度為7.60 mg/L樣品的回收率也達到99.30%，但15.20 mg/L樣品的回收率卻只有63.01%，卡方檢驗顯示測量值與真實值差異也不顯著(P= 0.069 4)，但相對偏差比較大，達到 ± 34.20%(見表1)，遠遠超過實驗室質量控制指標范圍[7]。上述結果表明，在測量范圍之內(0.04～4.32 mg/L)本法具有較高的準確度和可信度。

表1 亞硝酸氮測定回收率

2.4 其他含氮物質對測定的影響

表2列舉了硝酸鈉、氯化銨和蛋白胨(有機氮)標準溶液用API?亞硝酸氮檢測試劑盒處理后，反應液吸光度的變化。結果顯示，濃度為0.92～92.19 mg/L范圍的氯化銨引起的亞硝酸氮誤差濃度為0.02～0.09 mg/L，平均0.05 mg/L，稍高于亞硝酸氮的測量下限(0.04 mg/L)，卡方檢驗顯示誤差濃度與溶液中真實的亞硝酸氮濃度差異不顯著(P= 0.973)。與此類似，3.03～303.44 mg/L的硝酸鈉引起的亞硝酸氮濃度誤差為0.05～0.06 mg/L，平均0.058 mg/L，與真實濃度差異不顯著(P= 0.978)。有機氮對亞硝酸氮測定的干擾差異也不顯著(P= 0.783)，10～1 000mg/L(以總氮計)引起的誤差濃度僅為0.04～0.37mg/L。應用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法測定亞硝酸氮時，只有氯胺、氯、硫代硫酸鹽、聚磷酸鈉和高鐵離子等物質的干擾較大，而氨氮、硝酸氮和有機氮等的干擾較小[7]。陳靜儀等[9]也認為氨氮、硝酸氮等對亞硝酸氮測定的干擾較小，與本研究的結果一致。

表2 含氮物質對亞硝酸氮測定的影響

注：*，以大豆蛋白胨作為有機氮，濃度用總含氮量表示

3 結 語

結合分光光度法建立了應用試劑盒定量測定水體亞硝酸氮的方法，試劑用量少(200 μL)，操作簡便，測定結果與真實濃度無顯著性差異(P> 0.05)，具有較高的可信度，回收率在99%以上，回歸方程相關系數0.999 8，測定范圍0.04～4.32 mg/L，硝酸氮、氨氮和有機氮對測定的干擾也均不顯著(P> 0.05)，為水體亞硝酸氮的快速定量測定以及教學實驗提供了一種新的手段。