透射電鏡和光鏡聯合應用于細胞觀察

李紅梅, 張勤奮, 李茵茵, 張楚英, 張子健, 張以順

(中山大學 a.生命科學學院；b.華南腫瘤學國家重點實驗室，腫瘤防治中心，廣州 510275)

0 引 言

光學顯微鏡和電子顯微鏡都是探索微觀生命活動的重要工具，并提供了豐富的蛋白質定位、動力學以及細胞超微結構等信息[1]。自17世紀光學顯微鏡誕生以來，顯微鏡就一直是生物學家從事研究、探尋生命奧秘必不可少的利器[2-3]。透射電子顯微鏡的特點是分辨率高，對細胞的超微結構觀察具有極大的優勢，但缺點是沒法觀察活細胞、景深和觀察范圍小[1-3]。相反，光學顯微鏡具有景深大、觀察范圍廣，能進行活細胞觀察等特點[4-5]，結合免疫熒光技術在以蛋白、脂質或者離子作為靶標來探索細胞生理活動，其應用幾乎滲透到所有的細胞和分子生物學中，在細胞結構或組分的定位與半定量研究、活細胞在時間軸上的變化、脂膜的流動性分析、藥物篩選等方面研究有著重要貢獻[6-7]；激光共聚焦顯微鏡和超高分辨顯微鏡還可以獲得三維的圖像[7-8]，可以更好地了解細胞活動過程。跟其他儀器一樣，光學顯微鏡也有其技術缺陷，與透射電鏡相比，最突出的一點是其分辨率不夠高，普通光學顯微鏡的極限分辨率是200 nm，幾經發展，目前超高分辨熒光顯微鏡的分辨率提高了一個數量級，達到10 nm左右[9-11]。因此，光學顯微鏡和電子顯微鏡的聯用(光電聯用)能很好地彌補各自的缺點，可在原位獲得更多更全面、更精細和高分辨的細胞信息，近年來受到了廣泛的關注，尤其是冷凍光電聯用快速發展，也出現了一些尚未完全成熟且價格昂貴的光電聯用配套設備。總體而言，光電聯用技術對生命科學相關學科非常重要，但該技術還在不斷發展中。

本文嘗試使用大多數生命科學相關實驗室能得到的光學顯微鏡和最常用的生物電鏡設備，進行光電聯用，對處于分裂中期(M期)細胞進行觀察。

1 材料與方法

1.1 細胞培養及處理

采用刻有網格標記的培養皿μ-Slide CorrSight Live(ibidi，德國)培養細胞。培養皿共6個孔，每個孔中有橫向編號A-Z-a-e共31個數字，縱向編號從1～30，共900個小格，每個小格長度為100 μm，小格中可容納多個細胞。使用加有血清的普通細胞培養基(Gibico)。細胞采用已有穩定表達內質網駐留綠色熒光蛋白ER-EGFP 和融合紅色熒光的組蛋白H2B-mCherry的HeLa細胞。通過胸腺嘧啶核苷雙阻斷法配合RO3306阻滯釋放獲得分裂中期(M期)細胞。

1.2 光學顯微鏡觀察

首先在倒置熒光顯微鏡(IX73，OLYMPUS)的透射光明場下觀察，物鏡為10×PH。初步觀察細胞分布情況后，再在配有數值，孔徑為100×/1.49的油浸透鏡和固體激光器(488、561、647 nm)的超分辨顯微鏡(Nikon)上觀察，用ORCA-Flash 4.0(HAMAMATSU)數碼相機采集熒光圖像(見圖1)，并且記錄目標細胞所處的網格位置。再根據在超分辨顯微鏡觀察記錄的信息返回倒置顯微鏡，獲取更加詳細的定位信息，包括周圍細胞形態、數目分布等環境信息。

1.3 透射電鏡樣品制備及觀察

將上述帶有目標細胞的培養皿，連同上面的培養細胞進行原位樣品制備，用2.5%戊二醛2%多聚甲醛混合固定液4℃固定過夜后，吸棄廢液，用PBS(0.1 mol/L, pH 7.4)洗3次；1%的四氧化鋨(OSO4)常溫下固定1 h；回收OSO4廢液；再次用磷酸鹽緩沖液(PBS)(0.1 mol/L, pH 7.4)洗滌3次，每次10 min；乙醇溶液梯度脫水；濃度從低到高的SPI-812環氧樹脂進行滲透后，將事先用0.5 mL離心管盛裝的樹脂聚合成棒的粗的一頭削平，并輕輕倒扣在培養皿，接觸培養皿中的包埋劑(盡量避免氣泡產生)。由于其直徑和所使用的培養皿孔的差不多，樹脂棒一般在皿口位置，不會接觸細胞。放置于烘箱60℃聚合24 h。

圖1 熒光顯微鏡和透射電子顯微鏡在細胞觀察中聯用的實驗過程

聚合好的樹脂通過先加熱后放進液氮中冷卻的方法，將原來用于支持細胞的培養皿材料從聚合好的樣品塊剝離，借助網格標記鎖定目標細胞，用削塊機修去多余的部位。在超薄切片機(Leica EM UC6)用鉆石刀(Diatome)切成約100 nm厚的超薄切片。經2%的醋酸雙氧鈾和3%檸檬酸鉛雙染色。最后在透射電鏡(JEM-1400)下觀察。整個過程的流程圖見圖1。

2 結果和討論

2.1 光學顯微鏡觀察結果

首先在倒置熒光顯微鏡的明場下觀察，可看到所培養的細胞少部分呈分散分布，大部分成團單層分布，一個小格可有多個細胞(圖2(a))。雖然在同一培養皿中加入藥物處理細胞，但并不是所有的細胞都被阻斷在M期，有的細胞仍處在分裂間期。熒光顯微鏡檢查發現，M期細胞所占比例并不高。分裂間期的細胞有明顯的細胞核，部分內質網緊緊圍繞在細胞核周圍(圖2(b))。進入M期的細胞，細胞核內的遺傳物質聚集形成多個小團，內質網繞著成團的染色體存在(圖2(b))。

圖2 光學顯微鏡下的細胞分布、形態結構

(a)倒置顯微鏡下的細胞分布；(b)圖(a)局部放大圖；(c)左側細胞為分裂間期細胞，右側為M期細胞。可以看到M期細胞中染成紅色的組蛋白成團塊狀分布在細胞中，周圍有綠色標記的內質網分布。綠色EGFP標記內質網；紅色mCherry標記組蛋白

2.2 透射電鏡觀察結果

透射電鏡下，同樣可以觀察到兩種細胞形態同時存在。處于分裂間期的細胞(見圖3(a)，3(b))和處于細胞分裂M 期的細胞(見圖3(c)，3(d))。電鏡中觀察可發現兩種狀態細胞的內質網長度具有明顯不同。分裂間期細胞的內質網相對短，且有的地方內質網成鎖鏈狀，也沒有形成片層狀結構環繞細胞核。而M期細胞的內質網相對較長，成片層狀結構環繞著細胞核物質分布；此外，細胞內的線粒體、溶酶體等結構也可以在電鏡圖像中觀察到。有些線粒體發生空泡化現象，這些可能與實驗中使用藥物或培養時間過長有關。

圖3 電鏡下HeLa細胞被阻斷在分裂中期和在分裂間期的細胞形態

(a)分裂間期細胞。(b)圖(a)細胞的局部放大，可見線粒體、內質網和溶酶體等。(c)M期細胞；(d)圖(c)局部放大。N：細胞核，黑色箭頭：內質網，白色箭頭：溶酶體，五角星號：染色體，M：線粒體

2.3 光電聯用觀察結果

為了把光學顯微鏡和電鏡觀察結果對應起來，實驗中進行了光電聯用的嘗試。首先借助熒光標記，在488 nm和561 nm波長的激發光下可以看到紅色熒光蛋白標記的染色體/染色質和綠色熒光蛋白標記的內質網，通過超高分辨顯微鏡找到被阻滯在M期的細胞，采用ORCA-Flash 4.0數碼相機采集熒光圖像(圖4(a))，同時記下該細胞所在位置(D孔21CD小格間)。從熒光圖像可以看到目標細胞的染色體和包繞在其周圍的內質網。轉換到在倒置顯微鏡，在D孔21CD間的位置找到目標細胞，觀察細胞所處環境(圖4(b))，該處周圍有3團細胞，目標細胞處于其中一個細胞團的邊緣，目標細胞相鄰的一團細胞有個較大的梭形細胞，其形態特殊，可作為突出標志幫助后續定位。而后經過原位固定、脫水和包埋聚合。切片前，首先根據培養皿標記，確定靶標細胞所在部位，定位后對周圍進行修塊處理，最后進行超薄切片，染色后透射電子顯微鏡下觀察。電鏡下已不可能有培養皿的網格標記，此時倒置熒光顯微鏡下觀察到的細胞的形態及其周圍細胞的形態、分布可作為依據，幫助找到對應的目標細胞。本實驗倒置熒光顯微鏡下看到的那個大梭形細胞就可用來作為輔助靶標，幫助確定最后目標細胞(圖4(c))。實驗中該目標細胞的結果顯示內質網長長地包繞在染色體外(圖4(d))，這些結果跟熒光顯微鏡觀察的結果一致。同時，電鏡下還觀察到目標細胞具有呈典型的M期細胞特征，細胞核內染色體結構明顯，核周沒有明顯的核膜結構。此外還可看到細胞內的線粒體等亞細胞結構。

圖4 光電聯用實驗結果

(a)超高分辨顯微鏡獲得的M期細胞，綠色：內質網；紅色：染色體。(b)經戊二醛固定后在倒置顯微鏡獲得的圖像，目標細胞在21排的C和D列間(箭頭所示)，在其右側(21D)有一個圓的細胞和一個梭形細胞(三角形箭頭)。(c)透射電鏡較低倍數的圖像。圖中有個明顯的梭形細胞(三角形箭頭)，下方有3個細胞，根據(b)圖可以確定箭頭所示的目標細胞；(d)目標細胞的常規電鏡圖像

3 結 語

實驗結果表明，利用有標記的細胞培養皿、常規化學固定、常溫常規光學顯微鏡和電鏡等耗材和設備，可以進行光電聯用的研究并成功獲得結果。這對大多數農林、生命科學、醫學等相關學科的普通電鏡使用來說，一方面可以幫助獲得一些重要的結果；另一方面，本實驗使用的方法具有方便、成本低、易操作等特點，可以一定程度上為缺乏冷凍電鏡和冷凍光電聯用設備實驗室提供解決很多科研問題的新方法。