艾地苯醌對血管性癡呆大鼠海馬BDNF mRNA及受體TrkB mRNA表達的影響

錢旭東 王東 徐倩倩 李國蕓 王紅梅 張曉璇 馬征

(承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院 1神經內科，河北 承德 067000；2呼吸內科)

血管性癡呆(VD)發(fā)生的原因主要與腦血管因素有關，其發(fā)生基礎為腦組織受損而引發(fā)神經功能異常〔1，2〕。艾地苯醌對改善多種神經系統(tǒng)疾病造成的認知功能下降、VD治療方面有重要的臨床作用〔3～5〕。本實驗擬分析艾地苯醌對VD大鼠海馬腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)mRNA及高親和力受體酪氨酸激酶(Trk)B mRNA表達的影響。

1 材料與方法

1.1研究對象 選取100只雄性7周齡健康清潔級SD大鼠〔許可證號：SCXK(冀)2008-1-003，合格證號：1404010，河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供〕，體重250～300 g。每5只放到1個籠子中飼養(yǎng)，維持濕度50%～70%，維持室溫為20～25℃，給予顆粒型普通大鼠飼料，造模前予以適應性喂養(yǎng)1 w。

1.2主要試劑和儀器 TaqMan?RNA反轉錄試劑盒(美國ABI公司，Lot：20170634)，總RNA抽提試劑盒(No：K0731，美國賽默飛生物公司)，凝膠圖像分析系統(tǒng)(Biosens SC710，美國BIOTOP公司)，熒光定量PCR儀(LightCycler480，美國羅氏生物)，低速離心機(TDL5，上海安亭科學儀器廠)，miScript Ⅱ反轉錄試劑盒(上海凱杰生物公司)，山羊抗小鼠〔辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗，上海Abcam公司，貨號ab6789〕，Western印跡電化學發(fā)光(ECL)檢測試劑盒(Bio-Rad公司，貨號170-5060)，ZS-001 Moriss 水迷宮(北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限公司)，BDNF抗體、TrkB抗體(武漢博士德公司生產)；PCR擴增引物(上海生工公司生產)。

1.3建立模型及分組 模型建立方法：兩血管阻斷法(2-VO)。術前大鼠禁食12 h，禁水4 h，后腹腔注射10% 水合氯醛(3.5 ml/kg)麻醉大鼠，選取頸部正中為切口，將雙側頸總動脈進行分離后用4 號絲線結扎，最后將皮膚縫合并在傷口處注射慶大霉素(0.2萬U)，以便減小感染發(fā)生率，分離假手術組雙側頸動脈。艾地苯醌高劑量組、艾地苯醌低劑量組、對照組在建立模型后第3天進行藥物干預，艾地苯醌高劑量組灌服10 mg/kg艾地苯醌，艾地苯醌低劑量組灌服3 mg/kg艾地苯醌，對照組灌服11.06 mg/kg尼莫地平。模型組、假手術組灌服生理鹽水，保持灌服10 ml/kg，1次/d，連續(xù)灌服1個月。藥物干預、建立模型完成后剔除死亡大鼠，最終假手術組、艾地苯醌高劑量組、艾地苯醌低劑量組、對照組各20只。

1.4檢測大鼠學習記憶能力情況 藥物干預1個月后，Morris 水迷宮測試所有大鼠，共測試6 d，在前5 d只需測試定位航行，第6天測試空間探索。保持水深35 cm，水溫22℃，追蹤大鼠應用攝像頭。對采集的所有圖像、視頻等及時導入電腦并對分析數據。定位航行水點標記標準：將每一象限的中點作為水點進行標記，在大鼠找平臺位置的前2 min進行記錄，將平臺上停留時間>2 s作為逃避潛伏期。1 d記錄4次，最后計算出平均值。空間探索:將平臺拿走后選擇任何一個水點將大鼠放入，記錄2 min內大鼠跨越平臺的總次數，同時記錄停留時間。

1.5Western印跡測定BDNF、TrkB蛋白水平 選取腦組織：將所有大鼠處死后取出腦組織，應用刀片切開，將完整的左右雙側海馬進行鈍性分離，后將左側海馬組織及時放入液氮中冷凍1 h，后將其放入-80℃超低溫冰箱中。取約100 mg 組織后加入1 ml 10×蛋白變性緩沖液，100℃變性5 min，后將變性溶液加入10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)內，將溶液置入90 V恒壓中進行100 min電泳，當溴酚蘭跑出變性膠后停止電泳，后進行轉模。恒流轉移：在酸纖維素膜上放上SDS-PAGE后，轉膜成功進行封閉(3%BSA)，封閉后將其放在4℃環(huán)境下一夜，第2天磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗硝酸纖維素膜，按1∶500的比例將BDNF單克隆抗體加入其中，后在室溫下孵育45 min，孵育完成PBS沖洗硝酸纖維素膜；后對二抗進行孵育，按1∶1 000的比例將HRP標記的二抗加入其中，后室溫下孵育30 min，之后應用PBS沖洗硝酸纖維素膜，進行化學發(fā)光，后使用Kodak X曝光3 min進行成像操作。檢測各條帶吸光度值，內參照為β-actin，BDNF相對表達量應用灰度值表示，后采用同樣方法檢測組織中TrkB的表達。

1.6熒光定量PCR檢測BDNF、TrkB mRNA的表達 組織RNA提取：-80℃超低溫冰箱中取出海馬組織，研缽中迅速磨成粉末狀；取出100 mg粉末加入含有1 ml Trizol裂解液的EP管中，混合均勻；室溫靜止5 min，加入200 μl氯仿，充分混勻，室溫放置10 min；4℃離心分取上層水相，并放置RNase-free 1.5 ml離心管內，后加入等量的異丙醇充分震蕩，然后在冰上放置約30 min；取出離心管，再4℃離心分取得到RNA沉淀；應用500 μl 75%酒精洗滌RNA沉淀2次，風干；再加入50 μl RNase-free水在室溫下溶解RNA；應用NanoDrop檢測提取的RNA濃度，完成后將其放置-20℃條件下備用。

檢測定量PCR：對抽取的RNA進行體外反轉錄實驗，最終得到產物cDNA，操作時嚴格按照說明書進行；16℃條件下孵育30 min，42℃條件下孵育30 min，后85℃條件下加熱5 min，后放置4℃條件下保存。將cDNA作為模板進行熒光定量PCR檢測，反應體系為TaqMan?Universal PCR Master Mix 20 μl，操作儀器為羅氏LightCycler480，內參照為β-actin表達水平,ΔCT為BDNF相對值，ΔCT=CTβ-actin-CTBDNF，引物信息為BDNF：上游引物：5'-AGGGGCATAGACAATCG-3',下游引物:5'-TTCCCCTTGATAATGGTC-3';TrkB:上游引物:5'-AGTCGTCGAGACATGTC-3',下游引物:5'-CTGAAGACGGACTGTTG-3;β-actin:上游引物:5'-GCTGTCCCTGTATGCCTC-3',下游引物:5'-AGATGTCAGCGCACGAC-3'。采用同樣的方法檢測TrkB在RNA水平的表達。

1.7統(tǒng)計分析 應用SPSS18.0軟件進行χ2檢驗、方差分析及t檢驗。

2 結 果

2.15組定位航行比較 模型組逃避潛伏期〔(60.24±27.84)s〕顯著長于艾地苯醌低劑量組、艾地苯醌高劑量組、假手術組、對照組〔(42.51±20.12)s、(32.28±17.48)s、(21.37±15.45)s、(33.64±18.32)s，P<0.05〕，假手術組顯著短于艾地苯醌低劑量組、艾地苯醌高劑量組、對照組(P<0.05)；而相比于假手術組，艾地苯醌高劑量組和對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.25組空間探索結果比較 假手術組穿越原平臺次數、原平臺停留時間明顯多于艾地苯醌低劑量組、艾地苯醌高劑量組、模型組、對照組(P<0.05);模型組均明顯少于艾地苯醌低劑量組、艾地苯醌高劑量組、對照組(P<0.05)。艾地苯醌高劑量組與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組模型水迷宮探索結果比較

與假手術組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05

2.3各組腦海馬BDNF、TrkB 蛋白表達比較 模型組BDNF、TrkB 蛋白表達水平顯著低于艾地苯醌低劑量組、艾地苯醌高劑量組、假手術組、對照組(P<0.05)。與艾地苯醌高劑量組比較，艾地苯醌低劑量組均顯著降低(P<0.05)。見圖1，表2。

2.4各組腦海馬BDNF mRNA、TrkB mRNA表達比較 模型組TrkB mRNA、BDNF mRNA表達水平顯著低于艾地苯醌低劑量組、艾地苯醌高劑量組、假手術組、對照組(P<0.05)。與假手術組相比，艾地苯醌高劑量組和對照組均無顯著變化(P>0.05);而艾地苯醌低劑量組均顯著低于假手術組(P<0.05)。見表2。

A～E：假手術組、模型組、艾地苯醌低劑量組、艾地苯醌高劑量組、對照組圖1 各組腦海馬BDNF 和TrkB 蛋白表達

表2 各組腦海馬BDNF 和TrkB 蛋白及mRNA表達比較

與模型組比較：1)P<0.05；與艾地苯醌低劑量組比較：2)P<0.05

3 討 論

VD 的發(fā)生主要與腦部血管發(fā)生病變全腦組織或局部腦組織發(fā)生缺氧缺血，最終對腦部認知記憶、神經組織造成損傷顯著相關〔6〕。小腦、海馬體、大腦皮質對缺氧、缺血的敏感度非常高〔7〕。腦部缺血、缺氧導致?lián)p傷發(fā)生后會引發(fā)一系列級聯(lián)反應，如氧化應激反應、細胞死亡、炎性反應、梗死周圍去極化、興奮性氨基酸毒性、能量衰竭等，發(fā)生反應會對神經遞質的突觸傳遞、調節(jié)功能產生影響，進而對神經元造成一定的損傷，且會對學習記憶功能產生很大影響〔8，9〕。有研究表明，艾地苯醌可抑制炎性反應，進而會對小膠質細胞的生長繁殖過程產生抑制作用，從而在治療VD過程中發(fā)揮非常重要作用〔10〕。本實驗表明，腦缺血導致神經元損傷是引起癡呆的重要原因，艾地苯醌藥可以有效減輕缺氧、缺血對神經元造成的損傷，可以有效保護海馬神經元。

神經營養(yǎng)因子由多種細胞分泌，對外周神經系統(tǒng)、中樞系統(tǒng)發(fā)揮重要作用，它們通過自分泌、旁分泌、靶源分泌等多種形式發(fā)揮調節(jié)神經系統(tǒng)活動及代謝能力，該因子在修復損傷神經系統(tǒng)方面起著關鍵性作用〔11～13〕。BDNF廣泛存在于腦組織中，其在皮質、海馬體中的含量最多，作用為維持腦缺血后神經元的生長繁殖，促進神經元細胞、神經元軸突、樹突的生長繁殖，促使神經元突觸間遞質的分泌等，同時可以有效改善學習記憶功能，改善VD 認知功能〔14，15〕。BDNF通常與受體TrkB發(fā)生特異性結合，進而會增強細胞內酪氨酸激酶的生物活性，誘導TrkB發(fā)生磷酸化等，最終會刺激下游信號通路，對神經元進行保護〔16〕。當腦部組織發(fā)生缺氧、缺血時，BDNF、受體TrkB 的含量會明顯升高，當BDNF、受體TrkB 含量減少時，會使動物學習記憶受到嚴重損傷〔17〕。本研究結果表明，艾地苯醌可以提高BDNF、受體TrkB水平，可以有效刺激下游信號通道，進而有利于修復受損海馬神經元，最終提高VD 大鼠的學習能力、記憶能力。