變應性鼻炎患者外周血Treg細胞富集群中Tim-3表達上調

徐子琴 王帥 陳冬

(1輝縣市人民醫院耳鼻喉科，河南 輝縣 453600；2錦州醫科大學附屬第一醫院耳鼻喉頭頸外科)

變應性鼻炎(AR)是指個體暴露于過敏原后通過免疫球蛋白(Ig)E介導的介質釋放、并有多種細胞因子等參與的引起鼻腔黏膜炎癥的疾病，調查顯示AR疾病影響了全球10%～40%的人口，老年性AR的患病率呈逐年上升趨勢，目前以藥物治療控制臨床癥狀為主〔1～3〕，然而其發病機制不詳。隨著人們對調節性T細胞(Treg)的研究，逐漸發現它是致敏階段的關鍵細胞〔4〕。有學者研究發現，在AR小鼠模型及患者外周血中Treg細胞數目明顯減少〔5,6〕，然而針對Treg細胞免疫失衡的調控因素尚無定論。T細胞免疫球蛋白和黏蛋白結構域(Tim)-3是Ig和Tim家族細胞表面分子，廣泛參與腫瘤、哮喘及自身免疫性疾病等的免疫調節〔7〕，本研究主要探討Tim-3是否通過調控Treg細胞的免疫失衡，進而參與AR的發病。

1 材料與方法

1.1標本收集 選取2017年7月至2018年10月就診于錦州醫科大學附屬第一醫院的患者和招募的志愿者作為研究對象。研究對象均為年滿60周歲的老年人，均進行血清特異性IgE(sIgE)檢測。第一部分實驗：以招募的志愿者11例(男/女為4/7)為健康對照組，平均年齡(63.7±2.8)歲，以急性發作期入院的AR患者25例(男/女為9/16)為實驗組，平均年齡(64.1±3.7)歲。第二部分實驗：以急性發作期入院的AR患者30例，加入Tim-3的配體半乳糖凝集素(Galectin)-9激活前后進行對照比較。納入患者符合AR診斷和治療指南〔8〕的診斷標準依據。研究對象至少在1個月內沒有發生過呼吸道感染疾病，都未曾服過全身糖皮質激素、抗組胺藥、免疫抑制劑，除外結核、肝炎等傳染性疾病和其他全身性疾病。本臨床研究獲得錦州醫科大學附屬第一醫院倫理委員會的批準，且和每位招募的志愿者簽訂了知情同意書。各組受試者的性別、年齡等一般資料具有可比性。

1.2第一部分實驗 兩組均采集2 ml外周靜脈血，提取外周血中的單個核細胞(PBMC)加入FC受體(FcR)阻斷劑，均勻混合，避光孵育15 min后，加入APC/Cy7耦合的抗人CD4抗體、BV510耦合的抗人CD25抗體和PE耦合的抗人Tim-3抗體，避光孵育15 min后用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗,1 200 r/min離心棄上清，加入固定液,常溫避光45 min，然后加入破膜洗液，離心棄上清，再加入胞內Alexa647耦合的抗人叉頭框(Fox)P3抗體，室溫避光孵育1 h，最后加入對應破膜洗液，離心棄上清，用流式細胞儀檢測Treg百分比及其細胞表面的Tim-3表達，用Flowjo10分析實驗結果。

1.3第二部分實驗 提取外周血中的PBMC加入淋巴細胞激活劑〔丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)，離子霉素，高爾基體阻斷劑〕、半乳凝集素(Galectin)-9，37℃孵育4 h后加入1 ml的PBS，離心棄上清，加入FcR阻斷劑，室溫避光孵育15 min后，加入Percp/Cy5.5耦合的抗人CD3抗體、異硫氰酸熒光素(FITC)耦合的抗人CD8抗體、BV510耦合的抗人CD25抗體，避光孵育15 min后用PBS清洗,1 200 r/min離心棄上清，加入固定液400 μl,常溫避光45 min，然后加入破膜洗液，離心棄上清，再加入胞內Alexa647耦合的抗人FoxP3抗體和PE/Cy7耦合的抗人白細胞介素(IL)-10抗體,室溫避光孵育1 h，最后加入對應破膜洗液，離心棄上清，用流式細胞儀檢測Treg細胞分泌IL-10，用Flowjo10分析實驗結果。

1.4統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗、Fisher確切概率法、Maan-WhitneyU檢驗。

2 結 果

2.1兩組外周血中Treg細胞及Tim-3+Treg細胞的表達 實驗組Treg細胞百分比較對照組顯著降低(P<0.01)，而實驗組Treg細胞表面的Tim-3表達水平較健康對照組顯著增高(P<0.01)。見表1、圖1。

表1 兩組外周血中Treg及Tim-3+Treg比較

1:外周血淋巴細胞群；2：CD4+細胞群；3：實驗組Treg細胞；4：健康對照組Treg細胞；5：實驗組Tim-3+Treg細胞百分比；6：健康對照組Tim-3+Treg細胞百分比圖1 兩組外周血中Treg所占比例及Tim-3+Treg細胞的比例

2.2相關性分析 AR患者中Treg的表達與其表面Tim-3的表達呈負相關(r=-0.785，P<0.05)。

2.3激活劑阻斷前后外周血中Treg細胞比例及分泌IL-10+Treg的表達 阻斷后外周血Treg細胞百分比較阻斷前顯著上調(P<0.01)。阻斷IL-10+Treg較阻斷前顯著升高(P<0.001)。見表2、圖2。

表2 Tim-3激活阻斷劑前后兩組外周血中Treg及IL-10+Treg的百分比

1:外周血淋巴細胞群；2：CD4+細胞群；3：阻斷前Treg細胞百分比；4:阻斷后Treg細胞的百分比；5：阻斷前IL-10+Treg細胞百分比；6：阻斷后IL-10+Treg細胞的百分比圖2 激活劑阻斷前后Treg百分比及IL-10+Treg的百分比

3 討 論

AR是一種常見的過敏性疾病，主要是由IgE介導的，以釋放炎癥介質，并有多種細胞因子如肥大細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、T淋巴細胞等參與的鼻腔黏膜炎癥的反應性疾病，主要臨床癥狀是陣發性打噴嚏、流涕、鼻癢和鼻塞，嚴重者可伴發鼻息肉、鼻竇炎、哮喘及過敏性結膜炎等〔9〕。以前普遍以為AR主要由Th1/Th2細胞的免疫失衡反應所造成的，但隨著人們對AR疾病的不斷研究，該免疫失衡不足以解釋AR的炎癥反應。研究顯示Treg數目的改變或功能的缺失在過敏性疾病的發病機制中發揮重要作用〔10，11〕。

Tim-3是Tim家族中的一員。既往研究指出，Tim-3主要通過調控Th1/Th2細胞的平衡從而參與Th2細胞介導的疾病，比如過敏性哮喘〔12〕。Banerjee等〔13,14〕發現Tim-3可以通過調節Treg細胞從而參與哮喘、炎癥性疾病、自身免疫性疾病等的免疫調節,并在免疫自穩與凋亡細胞的清除過程中發揮重要作用，而Tim-3+FoxP3+Treg細胞的抑制功能要強于Tim-3-FoxP3+Treg細胞〔15〕。Galectin-9作為Tim-3的配體之一，與Tim-3結合后可以誘導T細胞的程序性死亡，被認為是Tim-3的激活劑〔16〕。有研究〔17〕表明Galectin-9可以通過抑制Th17細胞增強Foxp3+Treg從而改善自身免疫反應,但其作用依賴于與Tim-3的結合。本試驗顯示，體外給予激活劑Galectin-9后，患者血液中Treg細胞百分比及IL-10+Treg的百分比上調，提示了Galectin-9可以通過激活Tim-3通路抑制AR的炎癥反應。

綜上，Tim-3可能打破了Treg細胞在外周血中的平衡從而參與AR的發病過程；激活Galectin-9/Tim-3通路可以促使AR炎癥轉歸。這可能為AR的治療帶來新的思路。