慢性阻塞性肺疾病患者血清炎癥因子水平及其臨床意義

黃茉莉 梅曉冬 王衛陽

(1安徽醫科大學附屬省立醫院呼吸科，安徽 合肥 230000；2安徽省胸科醫院內一科)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)可根據病情進展分為穩定期和急性加重期。穩定期的主要臨床癥狀為不同程度呼吸困難，對患者肺功能及生活質量產生極大危害。其中炎性細胞分泌炎癥因子參與了COPD復雜的發病過程，炎癥反應使得氣道和肺組織炎癥反應增強，進一步導致肺功能進行性下降，出現呼吸衰竭甚至死亡。因此，為COPD患者提供有效的預防和治療方案對及時掌握病情，采取診治措施，減緩病情進展，提升其生活質量具有重要意義。本研究擬分析老年COPD患者血清中超敏C反應蛋白(hs-CRP)、腫瘤壞死因子(TNF)-α、血清白細胞介素(IL)-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-12等炎癥因子水平與肺功能指標第1秒用力呼氣容積(FEV1)/用力肺活量(FVC)與FEV1占預計值的百分比(FEV1/Pre)的關系。

1 對象與方法

1.1研究對象 連續入選2017年1月至2018年1月安徽省胸科醫院COPD患者82例，根據COPD嚴重程度分級分為COPD Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級、Ⅳ級組；選擇同時期在醫院呼吸內科門診檢測的正常體檢者為對照組41例，肺功能正常，且無呼吸道及惡性腫瘤等疾病。

納入標準：診斷標準遵照《慢性阻塞性肺疾病診治指南》(2013年修訂)；年齡≥54歲，性別不限；近期無感染史、手術及外傷；近期無使用抗生素或免疫調節劑者；同意簽署知情同意書。排除標準：患有嚴重心臟、腦部、肝腎疾病及惡性腫瘤者；長期使用糖皮質激素和病情嚴重需機械通氣者；其他部位存在感染者；合并其他全身性慢性疾病者。COPD組與對照組一般資料差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組基本資料比較

1.2儀器與試劑 hs-CRP測定試劑盒購自北京利德曼公司，人血清血漿α腫瘤壞死因子酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒購自上海心語生物科技有限公司，IL-8、人IL-2、人IL-4、人IL-6、人IL-12 ELISA檢測試劑盒購自美國R&D公司；肺功能機購自德國JAEGER公司，產品型號：MasterScreen。

1.3標本采集 使用肝素抗凝管抗凝采集兩組晨起空腹狀態時前臂外周靜脈血5 ml，3 000 r/min高速離心15 min，離心后將血清小心轉移至高壓蒸汽滅菌的EP管中，-80℃保存備用。

1.4肺功能指標FEV1/FVC與FEV1/Pre的測定 肺功能采用德國JAEGER公司MasterScreen肺功能檢測儀進行檢測，參照肺功能檢測操作指南，由專業技師嚴格按照儀器操作說明書指導患者進行檢測操作。觀察患者FEV1/Pre及FEV1/FVC。

1.5外周血TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-12含量的檢測 利用ELISA檢測血清中TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-12水平：將抗體用0.05 mol/L、pH9.6碳酸鈉-碳酸氫鈉溶液緩沖液稀釋至蛋白濃度為5 μg/ml。在聚苯乙烯板的反應孔中加100 μl，4℃孵育過夜。次日棄去孔內試劑，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，每次3 min。將待檢血液樣品用PBS按照1∶20稀釋，取100 μl加入上述已包被好的反應孔中，37℃孵箱孵育1 h，取出后洗滌3次。于各反應孔中加入新鮮稀釋的酶標抗體100 μl。37℃孵育1 h，洗滌5次。于各反應孔中加入臨時配制的3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)底物溶液100 μl，37℃避光孵育15 min，每孔滴入1滴2 mol/L碳酸終止反應。在熒光檢測儀上，以空白對照孔調零，于波長450 nm處測各孔OD值，若超過陰性對照OD值的2.1倍，視為陽性。

1.6血清hs-CRP水平的檢測 利用免疫比濁法測定血清hs-CRP水平。嚴格按照CRP測定試劑盒說明書進行操作。可溶性免疫復合物在稀釋體系中聚乙二醇的作用下，由液相析出形成微粒，導致反應液出現濁度。

1.7統計學處理 所有實驗至少重復3次，采用SPSS18.0軟件進行t檢驗、直線相關分析。

2 結 果

2.1各組FEV/Pre及FEV/FVC比較 與對照組比較，COPD組FEV/Pre及FEV/FVC均顯著降低，且隨著病情分級升高，降低越嚴重(P<0.05)，見表2。

2.2各組外周血hs-CRP TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-12水平 與對照組比較，COPD組hs-CRP、TNF-α、IL-6、IL-8指標均顯著升高，且隨著病情分級升高，各指標升高越明顯(P<0.05)；而IL-2只有COPD Ⅲ、Ⅳ級組與對照組及Ⅰ、Ⅱ組有統計學差異(P<0.05)，COPD Ⅰ、Ⅱ組與對照組無顯著差異(P>0.05)；而IL-4只有COPD Ⅳ級組與對照組及Ⅰ、Ⅱ組有統計學差異(P<0.05)，COPD Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組與對照組無顯著差異(P>0.05)；COPD各組IL-12顯著低于對照組，且隨著病情分級升高，降低越明顯(P<0.05)。見表3、表4。

表2 各組FEV1/Pre及FEV1/FVC比較

與對照組比較：1)P<0.05；與COPD Ⅰ級組比較：2)P<0.05；與COPDⅡ級組比較：3)P<0.01；與COPDⅢ級組比較：4)P<0.01

表3 各組外周血血清hs-CRP、TNF-α含量比較

與對照組比較：1)P<0.05；與COPD Ⅰ級組比較：2)P<0.05；與COPDⅡ級組比較：3)P<0.05；與COPD Ⅲ級組比較：4)P<0.05；表4同

表4 各組外周血血清IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-12含量比較

2.3患者FEV1/Pre及FEV1/FVC與血清hs-CRP、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-12含量的相關性 COPD患者外周血中FEV1/FVC與hs-CRP、TNF-α、IL-6、IL-8呈負相關，與IL-12呈正相關(P<0.05)，FEV1/Pre與hs-CRP、TNF-α、IL-6、IL-8呈明顯負相關，與IL-12呈正相關(P<0.05)，見表5。

3 討 論

COPD是以不完全可逆并呈進行性發展的持續存在的呼吸氣流受限為特征的慢性疾病，有害氣體或顆粒刺激氣道和肺導致慢性炎癥反應性增加，伴隨著氣道清除功能減弱，患者肺部功能嚴重下降，對患者的勞動和生活質量造成嚴重影響〔1〕。中性粒細胞、T細胞、巨噬細胞等炎癥細胞均參與了COPD炎癥反應過程，分泌炎癥因子并釋放炎癥介質，進一步破壞肺的結構和(或)促進炎癥反應〔2,3〕。研究證實，炎癥反應在COPD穩定期患者體內中也存在，且多發于全身多系統、多器官疾病，并不局限于肺部〔4〕。目前為止，COPD的主要治療方式為對癥治療，但并不能很好控制疾病癥狀、改善生活質量。研究報道，COPD患者早期的預防和診治是控制COPD疾病進程的關鍵〔5〕，因此發現更靈敏準確的診斷和預后指標成為了熱點研究問題。

Hs-CRP是由肝細胞合成的急性時相蛋白，機體受到組織損傷或吸入有害氣體等產生炎癥刺激時會大量釋放，且hs-CRP水平的上升不受放、化療及糖皮質激素治療的影響，可間接反映患者氣流受限的程度〔6,7〕，本研究結果證實COPD患者體內hs-CRP與肺功能指標FEV1/FVC、FEV1/Pre均呈顯著負相關，與之前的報道相一致〔5〕。

IL-2主要由T細胞分泌，具有活化T細胞、促進下游炎癥因子產生與特異性免疫反應的作用〔8,9〕，IL-4、IL-6、IL-8等炎癥因子的分泌均與IL-2的生物學功能有關〔10〕。IL-4主要由活化的Th2細胞分泌，研究證實IL-4與痰液在無纖毛的支氣管上皮細胞積聚有密切關聯，IL-4能誘導乳液腺蛋白合成增加，刺激支氣管杯狀細胞的黏液分泌，引起氣道局部水腫〔11,12〕。IL-4還可以調控其他炎癥因子的表達，產生炎癥性抗體引起免疫應激反應〔13〕。有研究報道hs-CRP、IL-2和IL-4可協同發揮趨化和活化氣道黏膜中炎癥細胞的作用，產生局部炎癥反應，參與COPD的發展過程。本研究結果提示，在COPD患者人群內血清IL-2與IL-4尚缺乏可以指示COPD患者肺功能的直接證據。

TNF-α是一種由單核-巨噬細胞產生的促炎因子，可誘導氣道內皮細胞表達黏附分子，增加黏液分泌，引起組織纖維增生并誘導IL-6、IL-8等細胞因子；IL-6是多功能細胞因子，常見于hs-CRP等急性期蛋白質的合成，可以誘導漿細胞活化，引發全身廣泛的特異性免疫反應，引起肺功能的降低；IL-8則對中性粒細胞具有明顯的趨化與活化功能，加重機體內的炎癥反應〔14,15〕。據報道，IL-6〔16〕、IL-8〔15〕及TNF-α〔17〕等炎癥因子在COPD患者中亦呈現高表達狀態，引起大量T淋巴細胞及中性粒細胞在黏膜內聚集，參與免疫反應及氣道炎癥，對小氣道和肺泡組織結構和功能造成損傷〔12,18〕。本研究結果表明炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-8水平可作為判斷COPD患者肺功能的指標。

IL-12是活化自然殺傷(NK)細胞和T細胞分泌的Th1型細胞因子，可以誘導NK細胞和T細胞分泌干擾素(IFN)-γ〔12〕，可介導機體固有免疫與適應性免疫〔19,20〕。研究顯示，急慢炎癥可下凋巨噬細胞分泌的IL-12，從而促進炎癥的發展〔21,22〕。本研究結果顯示COPD患者外周血IL-12水平顯著低于對照組，且隨著COPD分級增高，IL-12下降越明顯，與肺功能指標呈正相關，與之前的研究相一致〔5〕。

綜上，hs-CRP、TNF-α、IL-6、IL-8、IL-12與COPD患者肺功能指標存在顯著相關，可作為判斷COPD病情嚴重程度和預后的指標。