大分割適形放療在晚期非小細胞肺癌患者中的應用及放療抵抗發生與血清miR-123和肝細胞生長因子受體表達的關系

張利偉 石安輝 婁志霞 劉苓苓 孫瑞霞

(1中國科學院合肥腫瘤醫院腫瘤放療科，安徽 合肥 230031；2北京大學腫瘤醫院放療科)

肺癌是目前全世界范圍內發病率和惡性程度最高的惡性腫瘤，我國約85%肺癌屬于非小細胞肺癌(NSCLC)，50%～75%患者確診時已處于中晚期，喪失了早期手術切除機會，放化療是主要的臨床治療方案。常規分割放療主張單次小劑量、增加放療次數，雖然提高了放療安全性，在放療間歇期增加了腫瘤細胞再氧合、細胞周期再分布，也提高了下一次分割照射的敏感性〔1〕，但同時也發現更多的腫瘤細胞存活，增殖加快，導致再群體化，增加了放射抵抗性〔2〕。也有研究指出〔3〕，放療本身作為一種應激源，對腫瘤群體起到篩選作用，使原本不耐受放療的腫瘤細胞死亡，而放療耐受的細胞存活下來繼續增殖和轉移。大分割適形放療通過提高單次放療劑量和縮短放療次數，較常規放療提高了腫瘤細胞殺傷力度，縮短了整體治療療程，有效控制局部病灶，抑制腫瘤細胞的存活和再增殖活性，減少了放療抵抗，提高了患者存活率〔4〕。放療抵抗的產生導致放療失敗，患者臨床預后變差。放療抵抗的產生是多基因、多因子和多機制共同參與的病理生理過程，與放療方案、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/AKT/mTOR)信號通路活化程度、腫瘤干細胞的產生、多種微小RNA(microRNAs)的表達、肝細胞生長因子受體(HGFR)活性〔5～7〕等密切相關。本研究主要探討大分割適形放療在晚期NSCLC患者中的應用及放療抵抗發生與血清miR-123和HGFR表達的關系。

1 對象與方法

1.1對象資料 回顧性總結2015年1月至2017年12月中國科學院合肥腫瘤醫院及北京大學腫瘤醫院確診晚期NSCLC患者86例臨床資料，納入標準：①經影像學或CT引導腫瘤穿刺或支氣管鏡細胞活檢病理確診NSCLC；②TNM分期Ⅲb～Ⅳ期；③Karnofsky功能狀態(KPS)評分≥75分；④接受單純的大分割適形放療；⑤堅持完成規定療程，取得知情同意，臨床資料完善。排除標準：①存在放療禁忌；②應用化療、生物治療；③嚴重肝腎功能障礙。86例患者中男50例，女36例，年齡58～79〔平均(65.5±7.8)〕歲，體重指數(BMI)22.5～26.5〔平均(24.5±2.3)〕kg/m2，Ⅲb期62例，Ⅳ期24例，原發腫瘤最大直徑2.5～5.6〔平均(3.9±1.1)〕cm。

1.2放療方法 入院完善相關檢查，評估疾病嚴重程度和放療風險，大分割適形放療具體方案為仰臥位，醫科達公司(Electa)6D-Axesse高能直線加速器；壓力傳感器，定位體框架，真空負壓墊體位固定，Philips Brilliance CT Big Bore完成4DCT平掃+常規增強，對治療靶區與危及器官進行勾畫，確定內大體腫瘤體積(IGTV)、內臨床靶區(ICTV)、計劃靶區(PTV)；95%等劑量曲線對計劃靶體積環繞，設定容積調強放療(VMAT)單弧或者雙弧旋轉照射。處方劑量DT：3.5～6.0 Gy/次，5次/w，總劑量48～60 Gy，共2～3 w，同時對危及器官進行限量，注意對放療區域外的器官進行保護，放療間隙期加強營養支持，密切監測各項生命體征和血生化，對不適反應進行對癥處理。

1.3研究方法 放療結束后1個月評估臨床療效，入組患者至少存在一個可測量體積的原發腫瘤病灶，臨床療效參照實體瘤標準〔8〕分為顯效、有效、穩定和無效，其中顯效為腫瘤體積較基線水平至少縮小70%，無明顯并發癥，至少穩定1個月不復發；有效為腫瘤體積縮小40%～69%，至少穩定1個月不復發；穩定為腫瘤體積縮小≤39%，無新發腫瘤病灶；無效為腫瘤體積較前增加，或出現新發腫瘤病灶，或出現嚴重放療并發癥，需要終止治療。將顯效和有效定義為放療敏感，穩定和無效定義為放療抵抗。采用反轉錄PCR(RT-PCR)檢測血清miR-123水平，酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清HGFR水平。采集患者清晨空腹肘靜脈血10 ml，2 500 r/min離心15 min取上層血清，分裝2只EP管中，-80℃保存待檢，一支用于miR-123檢測，一支用于HGFR檢測。ELISA試劑購自美國Sigma公司，嚴格按照說明書步驟進行。

1.4RT-PCR主要步驟 在裝有兩組樣品試管中加入等體積萃取試劑Trizol，根據提示一步法提取完整細胞中RNA，減少RNA變性損失；然后測定其濃度和純度，根據反轉錄試劑盒提示合成cDNA；設計引物序列，miR-123：正義鏈5′-GGTTTCATCCAGGATCGAGCAGG-3′，反義鏈5′-ACAAAGATGGTCACGGTCTGCC-3′，445 bp；內參GAPDH：正義鏈5′-CGCGAGAAGATGACCCAGAT-3′，反義鏈：5′-GCACTGTGTTGGCGTACAGG-3′，225 bp。反應體系為cDNA 2 μl+上下引物各 3 μl+Taq 聚合酶0.5 μl，加無菌反應水至總體積為25 μl，反應條件為95℃ 5 min，(95℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 60 s)×30個循環，72℃ 10 min結束。2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物，數碼照相行灰度值分析，結果以目標引物與內參引物的灰度比值表示。

1.5統計學方法 采用SPSS20.0統計軟件進行t及χ2檢驗。

2 結 果

2.1放療抵抗的發生 86例患者均順利完成放療，療效評估中顯效39例，有效21例，穩定15例，無效11例，60例表現放療敏感，26例表現抵抗；兩組臨床資料差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 放療敏感組和抵抗組臨床資料比較

2.2兩組血清miR-123水平的比較 敏感組放療前和放療后1個月血清miR-123水平明顯低于抵抗組同時點(P<0.05)，敏感組放療后明顯低于放療前(P<0.05)，但抵抗組放療后與放療前比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 兩組血清miR-123水平的比較

2.3兩組血清HGFR水平比較 敏感組放療前和放療后1個月血清HGFR水平明顯低于抵抗組同時點(P<0.05)，敏感組放療后明顯低于放療前(P<0.05)，但抵抗組放療后與放療前比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 兩組血清HGFR水平的比較

3 討 論

腫瘤均會對放療產生一定的抵抗，不同的腫瘤對不同的放療方案產生抵抗率不同，這是目前臨床研究的熱點和難點〔9〕。關于放療產生的機制學說也有多種，認為與亞致死性損傷和再修復、細胞再增殖、細胞周期再分布和再氧和、微環境改變和乏氧細胞成分等有關〔10〕。放療在殺傷腫瘤細胞的同時，存活細胞和即將死亡細胞及周圍組織間質之間存在廣泛的聯系，經多種細胞因子、激素和生長因子進行信號轉導，進而影響腫瘤細胞基因的表達，最終產生放療抵抗〔11〕。

本研究結果提示，晚期NSCLC患者經大分割適形放療后產生抵抗率為30.2%。但是不同的研究對放療抵抗的定義不同，導致不同研究結果差異較大。目前對放療抵抗的定義也沒有統一標準。本研究著眼于臨床實際，采用放療后1個月腫瘤體積的變化區分放療效果，有一定的參考意義。本研究中放療敏感組與抵抗組患者的性別、年齡、BMI、腫瘤分期、最大直徑、病理分型和組織分化程度比較均無差異，提示患者和腫瘤的一般特征對預測放療抵抗風險可能價值不大。進一步發現，敏感組放療前和放療后1個月血清miR-123和HGFR水平明顯低于抵抗組，敏感組放療后明顯低于放療前，但抵抗組放療后與放療前比較差異不明顯，提示血清miR-123和HGFR水平上調可能預示放療抵抗的風險增加。

miR-123是一類19～25個核苷酸組成的小單鏈內源性非編碼RNA，主要生物學功能是與特定mRNA結合，阻斷效應蛋白編碼基因的表達，激活致癌通路、抑制抑癌基因活性、誘導相關腫瘤蛋白的表達來參與放療抵抗〔12〕。體外肺癌A549細胞實驗發現〔13〕，放射敏感細胞群中miR-123表達水平明顯高于抵抗細胞群，考慮與miR-123增加了放療過程中腫瘤細胞阻滯于G1期，誘導更多細胞凋亡有關。miR-123也表現抑癌效應，調節神經纖毛蛋白(NRP)-1表達活性增強NSCLC細胞的放射敏感性〔14〕。miR-123還能夠抑制HGF/c-Met信號通路活性，誘導NSCLC細胞凋亡，降低放療抵抗〔15〕。HGFR能夠與HGF特異性結合，HGF/c-Met是由c-Met原癌基因編碼的跨膜酪氨酸激酶受體，是腫瘤細胞增殖、侵襲及轉移過程中重要的信號通路〔16〕。約40%以上NSCLC組織中c-Met呈陽性表達，c-Met陽性往往預示NSCLC患者臨床預后較差〔17〕。HGFR表達上調提示HGF/c-Met信號通路活性增強，對放療抵抗風險增加，內在機制與放療誘導腫瘤細胞DNA損傷，激活DNA損傷修復，介導活化核因子(NF)-κB激活c-Met基因轉錄和HGF/c-Met信號通路相關蛋白的表達，增強細胞侵襲性，抑制細胞凋亡，增加放療抵抗性〔18〕。此外，PI3K/AKT信號通路也參與了多種腫瘤的發生、發展和轉歸，與腫瘤的放療抵抗機制有關。PI3K/AKT信號通路激活后可以抑制DNA雙鏈斷裂的主要修復機制，實現放射增敏作用；還可以作用于周期素D依賴蛋白激酶，調節細胞周期G1/S期轉化，參與腫瘤細胞的增殖和細胞周期分布，抑制PI3K/AKT信號通路使細胞阻滯于G1期，防止放射治療的再群體化，從而提高放療敏感性〔19〕。研究證實〔20〕，mTOR抑制劑能夠有效抑制PI3K/AKT信號通路活性，提高放療敏感性。腫瘤干細胞的存在也是放療抵抗的一個重要機制，腫瘤干細胞是腫瘤細胞中具有干細胞特性的異質性細胞，具有自我更新、多項分化潛能和不對稱分裂等功能，盡管數量只占腫瘤組織1%左右，但在腫瘤侵襲、復發和轉移中發揮重要作用〔21〕。腫瘤干細胞具有明顯的放療抵抗效應，促進DNA損傷修復、降低和清除活性氧、改變腫瘤微環境等多種途徑來逃避放療的殺傷作用。放療后即使殘留數量極少的腫瘤干細胞也能在放療間隙期大量增殖，造成腫瘤的復發和轉移，產生放療抵抗〔22〕。

綜上所述，盡管大分割適形放療在晚期NSCLC患者中有較好的安全性和有效性，但仍有一定的放療抵抗發生，可能與機體表達較高水平的miR-123和HGFR密切相關。研究不足是未能進一步闡述放療抵抗與miR-123和HGFR表達之間的內在聯系，以及miR-123和HGFR之間是否也存在緊密聯系，miR-123和HGFR是否能作為增加放療敏感性的干預靶點還需要進行深入探討。