樹突細(xì)胞-細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞在抗腫瘤生長(zhǎng)免疫治療中的應(yīng)用

趙芳 張睿 王娟 王建華 許衛(wèi)星 劉靜 尹風(fēng)雷 蔡秀萍 馬洪玉 楊博

(1滄州市中心醫(yī)院血液一科，河北 滄州 061000；2滄州市中心醫(yī)院胸外科)

治療惡性腫瘤的經(jīng)典方式為放療、化療、外科手術(shù)，但各自存在局限性，損壞機(jī)體免疫功能。細(xì)胞免疫治療方式在臨床研究與實(shí)際應(yīng)用的案例逐漸增多，作為治療惡性腫瘤的第四種方法受到腫瘤研究領(lǐng)域關(guān)注〔1〕。郭衛(wèi)東〔2〕探析樹突細(xì)胞(DC)-細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞(CIK)聯(lián)合化療治療晚期非小細(xì)胞肺癌的臨床效果，選擇某醫(yī)院兩年間治療的90例晚期非小細(xì)胞肺癌患者分為兩組，觀察6個(gè)周期，采用DC-CIK聯(lián)合化療治療，統(tǒng)計(jì)治愈率與生存率。Van Acker等〔3〕總結(jié)普通γ鏈家族細(xì)胞因子在γδT細(xì)胞抗癌免疫治療中的作用。常見γ鏈?zhǔn)荏w家族的細(xì)胞因子包括白細(xì)胞介素(IL)-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21，對(duì)于組織和維持健康免疫細(xì)胞功能至關(guān)重要。20世紀(jì)末期已經(jīng)開始細(xì)胞免疫治療的研究，研究對(duì)象包括淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞、腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞、CD3單體克隆抗體激活的殺傷細(xì)胞等〔4〕，研究顯示上述細(xì)胞均存在一定的殺瘤活性，因?yàn)榧?xì)胞增殖能力弱導(dǎo)致殺瘤效果不顯著。DC與CIK聯(lián)合作用即細(xì)胞免疫治療方法，DC-CIK聯(lián)合作用在免疫治療惡性腫瘤方面取得顯著成績(jī)〔5〕。其應(yīng)用領(lǐng)域廣泛、治療安全性強(qiáng)、毒副作用少是DC-CIK的顯著優(yōu)勢(shì)，具有明顯優(yōu)化機(jī)體免疫力，可增強(qiáng)抗瘤活性的功能，利于提升腫瘤患者生命，臨床研究前景廣闊〔6〕。本文分析惡性腫瘤患者進(jìn)行DC-CIK治療在抗腫瘤生長(zhǎng)免疫治療中效果。

1 材料與方法

1.1收集病例 選取滄州市中心醫(yī)院腫瘤診療中心的臨床病例26例，病理學(xué)顯示均為惡性腫瘤患者，全部接受手術(shù)與化療治療方式。其中，乳腺癌5例、肺癌4例、腎癌3例、肝癌5例、乳腺癌轉(zhuǎn)肝癌2例、肝癌轉(zhuǎn)骨癌5例、乳腺癌轉(zhuǎn)肺癌2例。隨機(jī)分為觀察組與對(duì)照組，各13例。患者及其家屬簽署免疫治療同意書，自愿參與腫瘤治療研究。上述患者排除顱內(nèi)轉(zhuǎn)移、重度心臟功能不健全情況，不存在重度精神病、并發(fā)性惡性腫瘤患者。兩組性別、年齡、美國(guó)東部腫瘤協(xié)作組(ECOG)評(píng)分、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)狀態(tài)、TNM分期不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見表1。

1.2儀器與材料 儀器設(shè)備為(1)低速與高速離心機(jī)分別購(gòu)自北京離心機(jī)廠、德國(guó)SIGMA公司；(2)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；(3)孵育箱型號(hào)為MCO-15AC，由日本三洋公司提供。試劑為(1)BTN無(wú)血清培養(yǎng)基由北京某生物有限公司提供；(2)CD3單抗與γ-干擾素(IFN)-γ由武漢生物研究所、上海克隆生物制品研究所提供；(3)淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自北京某生物有限公司；(4)IL-2由上海某生物技術(shù)有限公司提供；(5)人血白蛋白來(lái)自上海萊氏血液公司。

1.3DC與CIK鑒定 采集惡性腫瘤患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，利用粒細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、IL-4、腫瘤壞死因子(TNF)-α細(xì)胞因子誘導(dǎo)貼壁細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)證明為DC；利用CD3單抗、IFN-γ、IL-2細(xì)胞因子誘導(dǎo)懸浮細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)證明為CIK。

表1 兩組一般資料〔n(%)〕

1.4細(xì)胞培養(yǎng) ①DC培養(yǎng)：進(jìn)行外周血采集，采集前準(zhǔn)備如下：使用50 ml注射器抽取0.5 ml肝素抗凝劑、抽取生理鹽水10 ml，反復(fù)多次抽吸注射器；采集患者自身外周血各65 ml后，采用血細(xì)胞分離機(jī)、淋巴細(xì)胞分離液分離提取單個(gè)核細(xì)胞，數(shù)量在2.9×109個(gè)左右，淋巴細(xì)胞分離液使用量為1.066 g/ml。單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)RPMI1640洗滌(洗滌次數(shù)為2次，轉(zhuǎn)速為1 560 r/min，時(shí)長(zhǎng)為16 min)完成置入BTN無(wú)血清培養(yǎng)基混懸液在細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，存儲(chǔ)在孵育箱中，設(shè)置溫度為36.8℃、二氧化碳含量為4.8%。計(jì)時(shí)2 h，移除懸浮細(xì)胞后置入IL-4和GM-CSF溶液各510 U/ml、1 100 U/ml，相同環(huán)境下培養(yǎng)。培養(yǎng)期間，6 d加入一次TNF-α約510 U/ml；22～3 w換液一次，IL-4和GM-CSF溶液換液量同上；換液完成與細(xì)胞回輸前實(shí)施細(xì)菌與真菌培養(yǎng)檢測(cè)。②CIK培養(yǎng):將以上懸浮細(xì)胞作為基礎(chǔ)，使用無(wú)血清培養(yǎng)基至2×106U/ml，此時(shí)計(jì)時(shí)為第0天，同時(shí)置入CD3單抗與IFN-γ分別為1 μg/ml、2 000 μg/ml,孵育箱培養(yǎng)溫度與二氧化碳含量分別為36.8℃、4.8%，培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)為24 h。第一天置入IL-2溶液1 100 μg/ml相同環(huán)境培養(yǎng)。2～3 w換液一次，IL-4和GM-CSF溶液換液量為510 U/ml、1 100 U/ml；每次換液完成與細(xì)胞回輸前實(shí)施細(xì)菌與真菌培養(yǎng)檢測(cè)。③DC-CIK共培養(yǎng)：微力磕打DC培養(yǎng)瓶，令細(xì)胞處于貼壁懸浮狀態(tài)；傾倒DC至CIK培養(yǎng)瓶中進(jìn)行混合培養(yǎng)，孵育箱溫度為36.8℃、二氧化碳含量為4.8%。用以檢測(cè)DC-CIK共培養(yǎng)生成IFN-γ、IL-12、TNF-α細(xì)胞因子的能力。

1.5細(xì)胞回輸 DC回輸：細(xì)菌霉菌檢測(cè)在DC培養(yǎng)8、10、12、14 d后進(jìn)行，檢測(cè)結(jié)果為陰性，且活細(xì)胞比重在95.5%以上。使用細(xì)胞刷提取細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移到55 ml的離心管中，以15 min、1 500 r/min設(shè)定進(jìn)行離心操作。除去上清液后，在含有20 g/L人血白蛋白的生理鹽水中進(jìn)行洗滌，重復(fù)兩次；隨之將細(xì)胞懸浮存放在6.5～8.5 ml生理鹽水中，生理鹽水人血白蛋白含量為22 g/L。細(xì)胞回輸以每次3×108～8×108U的量進(jìn)行，注射位置為兩側(cè)頸部、腋下及腹股溝淋巴引流區(qū)，行皮下注射。CIK回輸：細(xì)菌霉菌檢測(cè)在CIK培養(yǎng)12、14、16 d進(jìn)行，檢測(cè)結(jié)果為陰性，且活細(xì)胞比重在95.5%以上。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到55 ml的離心管中，除去上清液后，在含有20 g/L人血白蛋白的生理鹽水中洗滌，重復(fù)兩次；隨后將細(xì)胞懸浮存放在260 ml生理鹽水中，生理鹽水人血白蛋白含量為22 g/L、IL-2含量為2×105IU，(1～3)×109為每次回輸細(xì)胞數(shù)量，使用輸血器以靜脈方式進(jìn)行輸注。CIK回輸注意事項(xiàng)：(1)予患者10%葡萄糖酸鈣與苯海拉明，防止出現(xiàn)過(guò)敏現(xiàn)象；(2)觀察患者回輸過(guò)程中是否出現(xiàn)寒戰(zhàn)、發(fā)熱、過(guò)敏現(xiàn)象，心肺功能是否產(chǎn)生變化，并正確記錄。細(xì)胞培養(yǎng)與回輸期間患者進(jìn)行40 d療程肌注，每隔一日進(jìn)行一次分別進(jìn)行IL-2 200萬(wàn)U肌注、α-2b干擾素300萬(wàn)U肌注。觀察組行DC與CIK回輸治療，對(duì)照組行CIK回輸治療。

1.6免疫治療評(píng)估 (1)免疫療效評(píng)估：總T細(xì)胞(CD3+)、輔助性T細(xì)胞(CD3+CD4+)、殺傷性T細(xì)胞(CD3+CD8+)、NK(CD3-CD56+)及CIK(CD3+CD56+)。免疫評(píng)估指標(biāo)分兩次檢測(cè)，一是療程前，二是4個(gè)周期治療后。(2)腫瘤治療效果評(píng)估：①有所進(jìn)展：患者自身癥狀減少20%以下，且癥狀始終呈現(xiàn)逐漸減少趨勢(shì)；②穩(wěn)定：患者自身癥狀減少20%～30%，且呈減少趨勢(shì)；③部分緩解：患者自身癥狀減少30%以上，且該情況保持4 w；④完全緩解：癥狀全部消失，保持4 w以上。

1.7指標(biāo)觀察與檢測(cè) (1)細(xì)胞免疫表型檢測(cè)：采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)培養(yǎng)8 w后的DC-CIK、CIK，記錄檢測(cè)結(jié)果。(2)細(xì)胞因子分析：IFN-γ、IL-12、TNF-α水平檢測(cè)方法為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)雙抗體夾心法。(3)記錄治療過(guò)程中不良反應(yīng)：包括發(fā)熱、發(fā)量減少、白細(xì)胞數(shù)量降低、血小板數(shù)量降低、惡心嘔吐及肝功能受損。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1不良反應(yīng)率 觀察組與對(duì)照組發(fā)量減少、發(fā)熱占比存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在白細(xì)胞數(shù)量降低、血小板數(shù)量降低、惡心嘔吐、肝功能受損方面，觀察組占比均低于對(duì)照組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.2細(xì)胞免疫表型 兩組CD3+、CD3+/CD4+、CD3+/CD8+、CD3+/CD56+陽(yáng)性細(xì)胞比例有顯著差異(P<0.05)。見表3。

表2 觀察組與對(duì)照組不良反應(yīng)率〔n(%)，n=13〕

表3 兩組細(xì)胞免疫表型

與對(duì)照組相比:1)P<0.05

2.3細(xì)胞上清液中分泌的細(xì)胞因子分析 對(duì)培養(yǎng)7 w后的CIK與DC-CIK上清液中分泌的細(xì)胞進(jìn)行因子檢測(cè)。CIK的IFN-γ、IL-12、TNF-α細(xì)胞因子表達(dá)均顯著低于DC-CIK(P<0.05)。見表4。

2.4腫瘤治療效果 兩組治療有效率存在顯著差異(P<0.05)。見表5。

表4 CIK與DC-CIK分泌的細(xì)胞因子

與CIK相比：1)P<0.05

表5 兩組腫瘤治療效果〔n(%)，n=13〕

4 討 論

生物工程技術(shù)與腫瘤免疫學(xué)科結(jié)合形成一種嶄新的生物治療方式，又稱為細(xì)胞免疫治療〔7〕。以調(diào)動(dòng)宿主原生防衛(wèi)機(jī)制或者給予機(jī)體特定物質(zhì)實(shí)現(xiàn)抗腫瘤效應(yīng)，本質(zhì)上是采用生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑改善患者抵抗力，令機(jī)體具備殺傷、抑制腫瘤的功能。

CIK研究顯示，利用人體外周血或者單個(gè)核細(xì)胞在體外與細(xì)胞因子結(jié)合、與CD3共同培養(yǎng)得到異質(zhì)細(xì)胞，即自然殺傷細(xì)胞樣T淋巴細(xì)胞，CIK占比為1.1%～5.1%。使用CIK進(jìn)行抗腫瘤免疫治療后，以往免疫療法存在體外增殖細(xì)胞數(shù)量不足、效果不顯著、副作用多的缺點(diǎn)得到改善，且基本不需注射IL-2〔8〕。迄今，研究未確定CIK殺傷靶細(xì)胞的原理，估計(jì)為腫瘤細(xì)胞和黏附因子結(jié)合后產(chǎn)生BLT酯酶顆粒，靶細(xì)胞膜被顆粒刺破后腫瘤細(xì)胞破裂；同時(shí)，IL-2、IL-6、TNF-α、GM-CSF是CIK細(xì)胞分泌的主要細(xì)胞因子，提升CIK誘導(dǎo)、殺傷腫瘤細(xì)胞的能力。

DC-CIK抗腫瘤療效表現(xiàn)為：效應(yīng)細(xì)胞殺傷腫瘤靶細(xì)胞的能力增強(qiáng)、免疫效應(yīng)細(xì)胞抗腫瘤活性提升。DC-CIK存在增殖速度快、殺瘤活性高的優(yōu)勢(shì)，并且殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)不傷害機(jī)體免疫系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能，改善機(jī)體免疫功能〔9〕。DC-CIK回輸治療采血量少、副作用小、適用于大部分腫瘤患者，同時(shí)治療效果顯著。采用DC-CIK治療惡性腫瘤過(guò)程中，醫(yī)護(hù)人員應(yīng)密切觀察患者的狀態(tài)與治療反應(yīng)〔10〕。已知具備最強(qiáng)抗原遞呈能力的抗原遞呈細(xì)胞為DC，在刺激幼稚T細(xì)胞活化與誘導(dǎo)特異性抗原免疫反應(yīng)方面效果顯著。免疫治療腫瘤的關(guān)鍵是CIK與DC，CIK利用細(xì)胞毒功能與分泌性能因子殺傷腫瘤細(xì)胞，DC負(fù)責(zé)辨識(shí)病原并激活獲得性免疫系統(tǒng)。

發(fā)熱是DC-CIK在抗腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中容易出現(xiàn)的不良反應(yīng)，由于回輸CIK懸液中存在IL-2與人血白蛋白導(dǎo)致患者發(fā)熱。所以，使用DC-CIK進(jìn)行抗腫瘤免疫治療過(guò)程中應(yīng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)患者的體溫、呼吸、血壓及脈搏等各項(xiàng)指標(biāo)，并準(zhǔn)確記錄，以便后續(xù)精準(zhǔn)分析患者病情。本文顯示，DC-CIK回輸后2.5～10.5 h，小部分患者體溫37.3～40.0℃，較大幅度升高；大部分患者體溫可自然降低，極少數(shù)患者復(fù)用降低藥后體溫正常，高體溫患者一般持續(xù)2.5～6.5 h。采用DC-CIK治療腫瘤時(shí)應(yīng)采取適當(dāng)措施緩解患者發(fā)熱的癥狀，預(yù)防措施為患者回輸前30 min左右肌肉注射苯海拉明20 mg、鹽酸異丙嗪25 mg。患者出現(xiàn)發(fā)熱癥狀時(shí)，在醫(yī)護(hù)人員指導(dǎo)下加量飲水，保持環(huán)境通風(fēng)。若患者持續(xù)發(fā)燒40℃以上，在醫(yī)生指導(dǎo)下藥物降溫。

相對(duì)化療與放療而言，DC-CIK免疫療法治療腫瘤過(guò)程中明顯改善患者白細(xì)胞降低、貧血等癥狀，患者免疫功能不易受損。