內皮特異性分子1在頭頸鱗癌中的表達及臨床意義

李群 周重昌 裘世杰 葉棟 鄧紅霞 沈毅 沈志森

頭頸部腫瘤最常見的病理類型為鱗狀細胞癌[1]，其發生率和死亡率在全球范圍內逐年升高[2]。由于頭頸鱗癌早期臨床癥狀不典型，大部分患者診斷時已發生淋巴結轉移并成為進展期惡性腫瘤。因此，尋找一種能早期篩查或診斷頭頸鱗癌的分子標志物是提高患者遠期生存的關鍵。內皮特異性分子1（endothelial specific molecule 1，ESM1）屬于蛋白聚糖家族，在內皮細胞中廣泛表達。研究表明，ESM1能促進內皮細胞遷移，從而促進新血管生成[3]。亦有研究表明，ESM1在腫瘤生長、發育和血管形成中發揮著重要作用[4]。目前已有研究表明，ESM1表達會影響結直腸癌、胃癌、鼻咽癌、肝細胞癌的增殖和轉移[5-8]。但關于ESM1在頭頸鱗癌中的作用尚未闡明。因此，本研究充分利用公共數據庫探索ESM1在頭頸鱗癌中的臨床應用價值，并結合患者生存數據分析ESM1表達對頭頸鱗癌患者預后的影響，同時探討ESM1在輔助診斷頭頸鱗癌中的價值，現將結果報道如下。

1 資料和方法

1.1 組織標本收集 選取2017年5月至2018年6月在本院接受手術治療的頭頸鱗癌患者49例，均經組織病理學確診，術前均未接受放化療。取49例頭頸鱗癌組織及癌旁正常組織，立即存入液氮，并及時轉入-80℃冰箱保存。本研究經醫院醫學倫理委員會審查通過，所有患者簽署知情同意書。

1.2 ESM1 mRNA表達水平檢測 （1）RNA提取和逆轉錄：應用Trizol試劑（美國Invitrogen公司）提取49對頭頸鱗癌組織及癌旁正常組織標本的總RNA。應用 Go－Script逆轉錄試劑盒（美國Promega公司）對總RNA進行逆轉錄反應，獲得cDNA。（2）RT-PCR：使用Roche公司 RT-PCR 儀（Light Cycler480），反應體系由 2×SYBR Green熒光染料、DNA聚合酶、PCR緩沖液、上下游引物和模板cDNA構成。以人GAPDH管家基因為內參基因，標準化目標cDNA的量。PCR反應條件：95℃預變性5min，95℃變性 30s，72℃退火 40s，72℃延伸 5min，循環42次。引物信息如下：ESM1正義5′-GGTGGACTGCCCTCAACACT-3′，反義 5′-AAGGTGCCGTAGGGACAGTCT-3′；GAPDH 正義 5′-GGGAAGGT-GAAGGTCGGAGT-3′，反義 5′-GGGGTCATTGATGGCAACA-3′[9]。每個樣本針對ESM1和GAPDH檢測均重復3次。樣本ESM1 mRNA 相對表達量=2-（Ct樣本-Ct內參）。

1.3 生物信息資源及分析 從腫瘤基因組計劃（TCGA）數據庫下載111例頭頸鱗癌組織及12例對照組織的全基因組表達數據（HTSeq-FPKM level 3）。應用R軟件limma模塊分析頭頸鱗癌中差異表達基因（差值≥2或＜-2且錯誤發現率＜0.05），最終確定差值最顯著的ESM1為研究目的基因。從基因表達譜動態分析（GEPIA）數據庫（http://gepia.cancer-pku.cn）下載 519例頭頸鱗癌組織及44例正常組織的ESM1表達、臨床分期及生存的數據，分析ESM1在頭頸鱗癌組織中的表達及其與患者預后的關系[10]。

1.4 基因富集分析 根據TCGA數據庫頭頸鱗癌樣本ESM1表達的中位數分為ESM1高、低表達組。應用GSEA軟件分析ESM1參與頭頸鱗癌進展的潛在信號通路。

1.5 統計學處理 應用SPSS 18.0統計軟件。頭頸鱗癌組織與其對應的癌旁正常組織ESM1表達水平比較采用配對樣本t檢驗；不同臨床分期患者頭頸鱗癌組織ESM1表達水平比較采用單因素方差分析。利用Kaplan-Meier法繪制ESM1高、低表達的頭頸鱗癌患者總生存期及無病生存期的生存曲線，采用log-rank法比較生存率。繪制ROC曲線分析ESM1表達檢測對頭頸鱗癌的診斷效能。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TCGA數據庫頭頸鱗癌差異表達基因的情況 對TCGA數據庫中111例頭頸鱗癌組織及12例對照組織的HTSeq-FPKM level 3全基因組數據進行差異表達基因分析，結果顯示頭頸鱗癌中有928個基因表達水平明顯低于對照組織，1 304個基因表達水平明顯高于對照組織，其中ESM1的表達差異最明顯，見圖1。

圖1 TCGA數據庫中頭頸鱗癌差異表達基因的火山圖

2.2 頭頸鱗癌組織與癌旁正常組織ESM1表達水平比較 對GEPIA數據庫519例頭頸鱗癌組織與44例癌旁正常組織中的ESM1表達水平進行比較，結果發現ESM1在頭頸鱗癌組織中的表達水平明顯高于癌旁正常組織（P＜0.05），見圖2a。為進一步驗證結果，筆者收集并檢測了49對頭頸鱗癌組織及其癌旁正常組織的ESM1表達水平，結果證實ESM1在頭頸鱗癌組織中的表達水平明顯高于其對應的癌旁正常組織（P＜0.05），見圖2b。

2.3 不同臨床分期患者頭頸鱗癌組織ESM1表達水平比較 對GEPIA數據庫519例不同臨床分期患者頭頸鱗癌組織ESM1表達水平進行比較，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖 3。

2.4 ESM1高、低表達頭頸鱗癌患者總生存期和無病生存期比較 根據ESM1表達的中位數，將GEPIA數據庫頭頸鱗癌組織樣本分為ESM1高表達組256例與ESM1低表達組259例，繪制ESM1高、低表達頭頸鱗癌患者總生存期及無病生存期的生存曲線，結果發現ESM1高表達組無病生存期高于ESM1低表達組（P＜0.05），ESM1高、低表達組總生存期比較差異無統計學意義（P＞0.05），見圖 4。

圖2 頭頸鱗癌組織與癌旁正常組織ESM1表達水平比較

圖3 不同臨床分期患者頭頸鱗癌組織ESM1表達水平比較

2.5 ESM1高表達在頭頸鱗癌中的基因富集分析 在明確ESM1與頭頸鱗癌預后有關后，進一步分析ESM1促進頭頸鱗癌發生、發展的可能機制。以KEGG參考基因集作為參考基因，對ESM1進行GSEA分析，結果顯示ESM1高表達的頭頸鱗癌樣本主要富集在MAPK信號通路、TGF-β信號通路等，提示ESM1可能通過上述信號通路參與頭頸鱗癌的發生、發展，見圖5（插頁）。

圖4 ESM1高、低表達頭頸鱗癌患者總生存期和無病生存期比較（a：總生存期；b：無病生存期）

圖5 ESM1高表達在頭頸鱗癌中的基因富集分析

2.6 ESM1表達檢測對頭頸鱗癌的診斷效能 49對頭頸鱗癌驗證樣本中，ESM1表達檢測診斷頭頸鱗癌的AUC為0.96，靈敏度為0.918，特異度為0.939，見圖6。提示ESM1可成為輔助診斷頭頸鱗癌的分子標志物。

3 討論

腫瘤的發生、發展和轉移是涉及多步驟、多基因的復雜過程。從基因水平研究腫瘤發生、發展和轉移等過程中基因譜變化，能為腫瘤早期診斷、治療方案的確定及預后判斷提供幫助。隨著腫瘤分子機制研究的不斷深入，目前已證實血管內皮細胞在上述變化過程中發生著功能和結構的變化。血管內皮細胞能被多種由腫瘤細胞分泌的細胞因子激活，形成癌栓；亦可被腫瘤細胞分泌的蛋白溶解酶破壞內皮結構，從而導致腫瘤細胞浸潤利于轉移；腫瘤細胞侵入繼發器官后，腫瘤細胞為持續增殖而刺激周邊形成新生血管，最終形成轉移灶。因此，對內皮細胞中各組分進行深入研究是了解腫瘤發生、發展和轉移機制的重要研究方向。ESM1是在1996年由法國科學家首先從人臍靜脈內皮細胞cDNA基因庫中克隆而來[11]。它是大小約50kDa的可溶性蛋白多糖，其成熟多肽包含165個氨基酸，在第137位絲氨酸殘端共價連接單一硫酸皮膚素鏈[11-12]。隨后，ESM1又被證實為硫酸皮膚素蛋白多糖[13]。它主要在人肺內皮細胞和腎內皮細胞中少量表達，后發現在多種內皮細胞中均有表達[11，13-14]，特別是炎癥內皮細胞。因此，ESM1被認為在心血管、炎癥和內皮功能障礙中發揮著作用。一項包含15項研究的薈萃分析發現，血漿中ESM1表達水平與患者罹患高血壓、冠心病等重大心血管疾病的風險密切相關[15]。此外，ESM1亦能與白細胞整合素（LFA-1）結合，阻止LFA-1與其特異性結合位點細胞間黏附分子-1（ICAM-1）相結合，從而影響炎癥部位對淋巴細胞的招募[16]。

圖6 頭頸鱗癌患者ESM1表達檢測診斷的ROC曲線

近期研究者們對ESM1在人類腫瘤發生、發展過程中的作用進行研究，結果發現在腎癌、乳腺癌、子宮內膜癌、胃及腸癌等多種人類腫瘤中，ESM1表達水平均明顯上調[17]。亦有研究表明，ESM1表達是肺癌等多種惡性腫瘤預后不佳的重要分子標志物之一[18-20]。本文對ESM1在頭頸鱗癌中的表達及臨床意義作一探討，以期為頭頸鱗癌的臨床診治提供新的方向。本研究通過分析公共數據庫中頭頸鱗癌全基因組表達數據，獲得差異表達基因2 234個，其中ESM1的表達差異最明顯。隨后在臨床收集的樣本中也證實了ESM1在頭頸鱗癌組織中的表達水平明顯高于其對應的癌旁正常組織。同時發現ESM1表達檢測診斷頭頸鱗癌的AUC為0.96，靈敏度為0.918，特異度為0.939。故筆者認為ESM1表達檢測具有簡便、靈敏度和特異度均較高的優勢，是輔助診斷頭頸鱗癌較為理想的指標。利用公共數據庫分析發現，不同臨床分期的頭頸鱗癌患者ESM1表達水平比較差異有統計學意義。隨后，根據ESM1表達的中位數將頭頸鱗癌患者分成ESM1高、低表達組，繪制生存曲線發現ESM1高表達組頭頸鱗癌患者無病生存期明顯高于低表達組，而兩組患者總生存期比較差異無統計學意義。待明確ESM1與頭頸鱗癌預后有關后，進一步分析ESM1促進頭頸鱗癌發生、發展的可能機制，結果顯示ESM1高表達能激活多種腫瘤相關信號通路，如MAPK信號通路、TGF-β信號通路等。

綜上所述，本研究證實頭頸鱗癌組織中ESM1表達水平明顯升高，ESM1表達可作為頭頸鱗癌的潛在分子診斷標志物，且有助于預測頭頸鱗癌的預后。