溫州地區耳聾患者SLC26A4基因突變分析

白文靜 潘勇 吳麗芳 項延包

耳聾是我國高發的出生缺陷疾病之一，在新生兒中的發病率為1‰～3‰，其致病因素包括環境和遺傳兩大類，其中遺傳因素占50%以上[1-3]。我國耳聾患者最常見的致聾基因為 GJB2、SLC26A4、GJB3及線粒體 12S rRNA等4種，其中SLC26A4基因在耳聾患者中的突變檢出率為5%～15%[4-7]。迄今已報道SLC26A4基因致病突變 460余種（http://deafnessvariationdatabase.org/）。由于該基因較大（包含21個外顯子）且具有很強的遺傳異質性，常表現為不同耳聾群體具有不同的突變圖譜。因此，通過檢測與分析不同地區耳聾群體的SLC26A4基因突變，以尋找不同群體的突變熱點，進而調整不同耳聾群體的檢測策略。本研究采用Sanger測序技術檢測187例非綜合征型耳聾患者的SLC26A4基因突變情況，以探討溫州地區耳聾患者的SLC26A4基因突變檢出率及基因突變圖譜。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2011年1月至2017年12月在本院門診就診的187例耳聾患者臨床資料及外周血樣本。其中男108例，女79例；均以聽力損失為唯一臨床表型；臨床診斷均為非綜合征型雙耳感音神經性耳聾，聽力分別為輕度（聽力閾值＞25～40dB）至極重度（聽力閾值＞90 dB）聽損不等。

1.2 方法 采用QIAGEN公司QIAamp DNA Mini Kit抽提試劑盒，抽提耳聾患者外周血DNA；各取2μl DNA樣本，使用紫外分光光度計分別進行定量和純度檢測。參考相關文獻[8-9]，對SLC26A4基因第7、8、19外顯子及其與內含子交界處的50bp進行PCR擴增及測序檢測，若上述片段范圍內檢出純合或復合雜合雙等位基因突變以及未檢出任何突變，則進入結果統計；若上述片段范圍內僅檢出單個位點雜合突變，則對SLC26A4基因剩余外顯子進行PCR擴增及Sanger測序分析。測序過程如下：先通過PCR擴增并將PCR擴增產物通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行分析確認，PCR產物于SAP酶混合液中純化，再行Cycle測序反應。反應產物通過NaAc-乙醇法進行純化，并在ABI3130 DNA全自動測序儀上進行測序。

1.3 統計學處理 應用DNAstar軟件讀取測序數據，并用SeqMan軟件將所測序列與NCBI中的基因標準序列進行比對分析，記錄序列比對結果。

2 結果

187例耳聾患者中有22例患者檢出SLC26A4基因突變，占11.76%；其中SLC26A4雜合突變4例（2.13%），純合或復合雜合突變18例（9.63%）。22例患者共檢出11種SLC26A4基因分型，包括5例c.919-2A＞G/c.2168A＞G、4例 c.919-2A＞G雜合突變、4例 c.919-2A＞G純合突變、2例c.919-2A＞G/c.416-1G＞A、1例c.919-2A＞G/c.946G＞T、1例 c.919-2A＞G/c.1229C＞T、1例 c.919-2A＞G/c.1607A＞G、1例 c.919-2A＞G/c.1707+5G＞A、1例 c.919-2A＞G/c.1975G＞C、1例 c.919-2A＞G/c.2167C＞G、1例 c.2168A＞G/c.281C＞T，見表1。

22例基因突變患者共檢出SLC26A4基因10種40次突變，其中c.919-2A＞G檢出率最高，占總等位基因的6.68%（25/374）；c.2168A＞G突變6次，占總等位基因的1.60%（6/374）；c.416-1G＞A突變2次，占總等位基因的 0.53%（2/374）；c.281C＞T、c.946G＞T、c.1229C＞T、c.1607A＞G、c.1707+5G＞A、c.1975G＞C、c.2167C＞G各突變1次，分別占總等位基因的0.27%（1/374），見表2。

3 討論

本研究結果顯示，溫州地區187例非綜合性型耳聾患者共檢出22例存在SLC26A4基因突變，占11.76%，其中9.63%存在雙等位基因突變，這與我國其他地區報道的5%～15%的基因突變檢出率相近[5，10-11]。在等位基因突變頻率中，c.919-2A＞G、c.2168A＞G所占比例最高，是溫州地區非綜合征耳聾患者SLC26A4基因突變最主要的類型，與我國其他地區報道結果亦相同[5，10-11]。SLC26A4基因是常染色體隱性遺傳，但全編碼區測序范圍內檢測仍有4例為單位點雜合突變患者，推測可能存在基因上游調控區的未知點突變或是拷貝數變異導致復合雜合致病，亦或是該類個體僅單純的為人群基因雜合突變攜帶者[5，12]。

表1 SLC26A4基因突變患者基因分型（n=187）

表2 SLC26A4基因突變及其頻率（n=374）

22例基因突變患者共檢出10種致病突變，其中c.281C＞T、c.1229C＞T、c.1607A＞G、c.1975G＞C、c.2167C＞G以及c.2168A＞G為錯義突變，分別導致SLC26A4基因編碼蛋白第 94、410、536、659、723、723 位點發生氨基酸替換；c.946G＞T為無義突變，導致編碼蛋白發生提前終止而截短；c.416-1G＞A、c.919-2A＞G、c.1707+5G＞A為剪接突變，導致編碼蛋白的外顯子拼接發生剪接錯誤；上述突變均致使SLC26A4基因編碼產生非正常功能的PDS蛋白，使內耳胞間離子交換受阻，最終導致耳聾臨床表型的發生[13-16]。除了高檢出率的c.919-2A＞G與c.2168A＞G突變外，其余8種罕見突變分別位于基因不同的外顯子或內含子上，這表明對檢出存在熱點位點雜合突變的耳聾患者應對剩余所有的外顯子及與內含子交界處片段的位點進行突變檢測，進而提高SLC26A4基因突變檢出率。

綜上所述，SLC26A4基因是溫州地區非綜合型耳聾患者的主要致聾基因之一，c.919-2A＞G、c.2168A＞G是該地區SLC26A4基因突變最主要的類型，與我國其他地區耳聾群體數據相似。此外，本研究同時檢出了多種熱點以外的罕見突變，豐富了溫州地區耳聾患者的遺傳突變圖譜，為本地區耳聾患者的基因診斷和遺傳咨詢提供了數據基礎和遺傳學理論指導。