操作臺溫度對小鼠卵母細胞受精及胚胎發育的影響

韓 爍，周雯慧，李 媛

（首都醫科大學附屬北京朝陽醫院 生殖醫學中心，北京 100020）

卵母細胞體外受精及胚胎發育對生長環境有嚴格的要求，溫度是重要的一個關鍵影響因素[1]。人的基礎體溫是37°C，所以最適宜卵母細胞成熟及胚胎發育的溫度是37°C。但是在卵母細胞體外受精和胚胎發育的實際操作過程中，操作環境很難保持恒定的37°C，為了保證實驗室人員的正常工作環境，實驗室的空氣溫度都低于37°C，因此培養皿離開培養箱到操作臺，這個時間段中培養皿的溫度會有所下降，為了減少室溫對卵母細胞和胚胎的影響，操作臺溫度的設定就尤為重要，溫度下降會影響卵子內部的一些結構變化特別是成熟過程中的卵母細胞[2]。在整個體外培養的操作中，卵母細胞的收集耗時最長，暴露在外的時間最多。常規操作臺的設定溫度為37.0°C±0.5°C，但是培養皿內培養液的溫度受到室溫和空氣流動的影響，2 種因素均會降低培養皿內的液體溫度。在操作臺溫度設定為37°C 時，在培養皿和液體的熱量傳遞過程中會有時間耗損和熱能耗損，導致培養液滴內的溫度達不到37°C，提高操作臺溫度是否對卵母細胞的受精和胚胎發育有影響尚鮮見報道。本研究旨在探討提高操作臺的溫度后對卵母細胞的受精和胚胎的后續發育的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

清潔級C57 雌性小鼠40 只，雄鼠10 只，鼠齡8～10 周，體重30～40g，小鼠由北京維通利華聯合實驗動物技術有限公司提供。小鼠生長環境自然光照，飼養條件為光照14h，黑暗10h，小鼠可自由飲水和攝食，適應性飼養10d 后進入實驗階段。

1.2 收集卵母細胞

實驗設置4 組，每組10 只小鼠，分別為實驗組1、實驗組2、實驗組3 和對照組。實驗組1：在卵母細胞收集期和胚胎培養期，操作臺溫度均為38.0±0.2°C；實驗組2：在卵母細胞收集期操作臺溫度為38.0±0.2°C，在胚胎培養期操作臺溫度為37.0±0.2°C；實驗組3：在卵母細胞收集期操作臺溫度為37.0±0.2°C，在胚胎培養期操作臺溫度為38.0±0.2°C；對照組：在卵母細胞收集期和胚胎培養期，操作臺溫度均為37.0±0.2°C。分組條件可見表1。

小鼠動情周期d3 起，晨8 點腹腔注射促性腺激素釋放激素激動劑（Gonadotropin-releasing hormone agonist，GnRHa，曲普瑞林，德國輝凌公司）0.02μg/g。至動情周期d9 腹腔注射孕馬血清促性腺 激 素 （pregnant mare's serum gonadotropin，PMSG）0.4IU/g，在首次注射Gn 后48h，腹腔注射絨毛膜促性腺激素 （human chorionic gonadotropin，HCG）0.4IU/g，16～18h 后頸椎脫臼法處死小鼠，無菌操作下迅速取出雙側輸卵管，顯微鏡下觀察后自膨大部一端沖洗取出卵母細胞復合物，受精液（G-IVF，Vitrolife）沖洗后培養其中。每只小鼠從取出雙側輸卵管到完成收集卵母細胞復合物的時間控制在5min 內。

1.3 收集小鼠精子

采用頸椎脫臼法處死小鼠，無菌條件下剪取雙側附睪、附睪尾及附睪尾近端輸精管，每側組織剪成4～6 塊，放入受精液（G-IVF，Vitrolife）中，在37°C、6%CO2飽和濕度培養箱中培養上游20min，后去除附睪及組織塊，精子繼續獲能1.5～2h。

表1 實驗分組條件

1.4 體外受精與胚胎培養

將收集的卵母細胞按照分組進行體外培養。隨后置于獲能的精子微滴（10～20 個卵/100μl 的微滴，精子密度為5×105/ml）中，放置在37°C、6%CO2的飽和濕度的培養箱中培養12h，后轉移至卵裂胚培養液（G-1-PLUS，Vitrolife）微滴中繼續培養，48h 后轉移至囊胚培養液（G-2-PLUS，Vitrolife）微滴中培養36h，觀察記錄全程胚胎發育情況（原核期，卵裂期，囊胚期）。

1.5 統計學處理

采用SPSS23.0 軟件進行統計學分析，組內比較采用t 檢驗。

2 結果

2.1 操作臺溫度對卵母細胞受精情況的影響

胚胎培養期包括胚胎卵裂和囊胚形成。小鼠胚胎正常受精時，可在倒置顯微鏡下觀察到兩原核形成（two pro-nucleate，2PN），但是異常受精時會出現一個原核（one pro-nucleate，1PN）。實驗組3 和對照組相比，小鼠卵母細胞的受精率、胚胎卵裂率和囊胚形成率沒有差異。當卵母細胞收集的操作臺溫度在38.0±0.2°C 的條件下，實驗組2 的2PN 率為89.82%，對照組為96.25%，且有顯著性差異（P＜0.05）；實驗組1 為卵母細胞收集期和胚胎培養期的操作臺溫度均為38.0±0.2°C，和對照組相比，1PN 形成率顯著升高（表2）。

表2 操作臺不同溫度下小鼠卵母細胞受精及胚胎發育情況 n（%）

2.2 操作臺溫度對胚胎卵裂情況的影響

實驗組1 的胚胎卵裂率為31.61%，顯著低于對照組 （P＜0.05）。實驗組2 的胚胎卵裂率為40.01%，小于對照組，但無顯著性差異；實驗組3和對照組相比胚胎卵裂率相似（表2）。

2.3 操作臺溫度對囊胚形成率的影響

實驗組1、2 的囊胚形成率分別為44.18%和41.66%，均顯著小于對照組的囊胚形成率57.50%（均P＜0.05）。實驗組3 的囊胚形成率與對照組相比無顯著性差異（表2）。

3 討論

卵母細胞的體外操作包括3 個過程，37°C 的培養箱（人體）到室溫，室溫到操作臺，再從操作臺進入室溫后進入37°C 的培養箱。整個過程中減少溫度的波動程度非常重要。操作臺的加熱裝置不是恒定的，同一加熱臺的不同點溫度會有差異，因此最適合的溫度范圍是研究的重點。許多研究中心認為在層流和培養皿的隔離作用下，為了保證培養滴的溫度達到37°C，需要將操作臺的溫度提高至37.5°C 甚至38°C，因此為了探究是否提高操作臺溫度有助于卵母細胞的受精和胚胎的發育，我們設立了37.0±0.2°C 和38.0±0.2°C 為自變量，考慮到卵母細胞和胚胎具有不同的結構和生理特性，我們在時間上劃分了2 個時期，卵母細胞收集期和胚胎培養期。在本次研究中我們發現，卵母細胞收集期的操作臺溫度升高1°C，對小鼠卵母細胞的受精、胚胎卵裂和囊胚形成有顯著影響。胚胎卵裂和囊胚形成期的操作臺溫度升高1°C，對胚胎正常卵裂和囊胚形成無影響。

卵母細胞收集期操作臺溫度提高至38°C 并沒有增加卵母細胞正常受精率，反而將低了2PN形成率，提高了異常受精率，同時胚胎培養期的操作臺溫度升高至38°C 對胚胎正常卵裂和囊胚形成無影響。這個研究結果充分說明為了減少卵母細胞和胚胎的體外操作溫度損失而提高操作臺的溫度對卵母細胞的受精、胚胎發育不僅沒有益處，反而會影響卵母細胞正常受精和胚胎發育。

因為卵母細胞在成熟過程中，溫度的變化對卵母細胞的成熟和后期胚胎發育都會產生影響，有文獻報道環境溫度的升高會對紡錘體的形態造成干擾，細胞內微管在溫度的升高下聚集，過高的溫度會破壞紡錘體的形態，對卵母細胞造成不可逆的影響[3，4]。

盡管本項研究采用的模式動物為小鼠，但是其他豬卵母細胞相關研究結果也獲得了類似的結論。Hunter 等人測定豬的卵泡發育和體內溫度時發現，豬卵泡內的溫度要低于37°C，因此建議在卵母細胞收集過程中降低操作時的溫度[5]。2018年文獻報道了比較牛卵母細胞在36.5°C 和38.5°C 不同的培養環境中，卵母細胞的受精和胚胎發育情況，研究結果表明在36.5°C 的培養環境中牛卵母細胞獲得了更好的成熟及后續胚胎發育[6]。另一項研究表明，在牛卵巢中，卵泡液溫度較低的卵泡中的卵母細胞可能發育得更成熟[7]。在本項研究中，操作臺溫度設定為36°C 時小鼠卵母細胞的受精及胚胎發育情況未涉及，在下一步的研究中會繼續探索。